Når det gælder om at dyrke bakteriekolonier, træder LB-agar op på pladen – men først skal man få det i geltilstand (en situation, som dets ven agarose sikkert kan forholde sig til!) “-ose” er en endelse, der normalt bruges til at angive, at noget er et sukker – og agarose er et sukker – men det er agar også! Så hvad er forskellen? De er beslægtede, men de adskiller sig med mere end blot et par bogstaver, og disse forskelle gør dem nyttige til fremstilling af gelmatricer til forskellige opgaver – agarosegel til adskillelse af DNA-fragmenter efter størrelse og agargelplader til dyrkning af bakterier)
En gar er en fiskelignende ting, og AGAR (også kendt som agar-agar (seriøst!)) er en blanding af 2 sukkerarter – agaropectin & den, vi er mere bekendt med, agarose. Så man får agarose ved at rense agar. Og for at forstå, hvorfor man nogle gange går igennem det besvær, men ikke andre gange, hjælper det at vide lidt mere om, hvad disse sukkerarter er.
Agarose er et polysaccharid (“poly” betyder mange & sacchariders sukker, så et polysaccharid er en lang kæde af gentagne sukkerunderenheder, der er forbundet med hinanden). Det er et eksempel på en polymer. Polymerer er lange kæder af gentagne underenheder. Forskellige polymerer har underenheder af forskellige typer (f.eks. er nukleotidunderenheder forbundet til de polymerer, vi kalder DNA eller RNA; aminosyrer er forbundet til proteiner; og monosaccharidsukker er kædeforbundet til komplekse kulhydrater (som agarose!))
Sukkerstoffer har masser af hydroxylgrupper (-OH) (som vand gerne klæber til, hvilket hjælper dig med at danne en gel – et “uendeligt” indbyrdes forbundet (som 7° Kevin bacon) polymernet, der indeholder vand. (mere kommer senere)). Individuelle sukkerenheder (monosaccharider) antager ofte ringstrukturer (som det er tilfældet i agarose), hvor -OH-grupperne stikker ud som ben. Sukkerstoffer kan have den samme “binding”, men have de forbundne grupper stikkende ud på forskellige måder & vi bruger “L” og “D” for at henvise til, hvilken retning i rummet benene peger. Mere om sådan stereokemi her: bit.ly/2Q8Dnax
Monosaccharider kan bruge deres -OH’er til at binde sig sammen. Ved at kæde 2 sammen får man et disaccharid . Tilføj et par stykker mere, og du får oligosaccharider (oligo betyder få). Hvis man forbinder mange, får man et polysaccharid (poly betyder mange).
Og når vi taler om mange, betyder de mange -OH’er, at der er flere potentielle bindingssteder (som vi specificerer ved at angive, hvilket antal “adresser” på sukkerringene der er forbundet). Man kan få “forgreninger”, men i agarose har man lineære kæder (af ca. 400 underenheder). (Selv om man kan indføre forgreninger ved hjælp af “crosslinkers” for at styrke agarose, så den kan gøre ting som at lave størrelseseksklusionskromatografi (“gelfiltrering”) harpiks, der kan modstå de høje tryk, der genereres i FPLC (Fast performance liquid chromatography).
I agarose er den gentagne underenhed en sukkerduo (disaccharid) af galactose (D-galactose for at være præcis) forbundet med et modificeret galactose-monosaccharid, 3,6-anhydro-L-galactose. Vi kalder denne duo AGAROBIOSE (Ved at knytte en galactose til en glucose får man lactose, et disaccharid, som du måske er mere bekendt med).
I galactose har ringene 6 sider med 4 -OH-ben, 5 -H-ben, & 1 methylhydroxyl (-CH₂OH)-ben. Vi tegner ofte ikke “-H”-benene, fordi de skjuler de mere interessante ben, som er i stand til at reagere. I agaroses modificerede galactose har 2 af -OH-grupperne forbundet & sparket et hydrogen ud (“anhydro”), således at methylhydroxylarmen er brolagt til en -OH-arm og danner en “bro” over ringen.
Omkring 2/3 af agar er agarose, men, agar indeholder også AGAROPECTIN. Det ligner virkelig hinanden (det har vekslende D & L-galaktoser) MEN mange af disse galaktoser har modifikationer. Der er flere forskellige modifikationer, herunder tilføjelse af sulfat(er), pyrubrinsyre eller methylgrupper, eller indslusning af en af de forbundne benversioner som i agarose.
I modsætning til den konsekvente gentagende natur i AGAROSE er det kun det vekslende D- & L-galaktose-“skelet”, der er konsekvent i agaropectin. Dens modifikationer er spredt ud over hele kæden (f.eks. er ~hver 10. knyttet til et sulfat gennem en -O-sulfatbinding, men det er kun i gennemsnit, og det er ikke sandsynligt, at de er præcist, jævnt fordelt). Og, mens kæderne har tendens til at være kortere end agarosekæderne, er deres længde også variabel, så agaropektin er virkelig noget af en blanding & man ved aldrig helt, hvad man får!
Hvorfor bruge det ene frem for det andet?
DNA har en masse negativt ladede fosfatgrupper (fosfor omgivet af 4 oxygener). Dette vil tjene som grundlag for, at de bevæger sig gennem gelen mod den positive ende. Vi har altså brug for, at gelen er neutral.
Agar har mange sulfatgrupper (svovl omgivet af oxygener). Disse er også negativt ladede, så de kan forstyrre, hvordan DNA’et bevæger sig gennem gelen. Så det ville være en dårlig matrix til elektroforese.
Men agarose er neutral, hvilket gør den til en god matrix til elektroforese.
Men agarose er også dyrere, fordi den skal oprenses. Så hvis du ikke behøver at bekymre dig om det fysiske ladningsproblem, kan du lige så godt bruge noget, der har en lavere *monetær* ladning! Fordi agar kræver mindre forarbejdning, er det billigere & perfekt til brug som en matrix til at holde bakteriemad!.
I agarplader er det ikke selve agaren, der tilfører næringsstoffer. Det er en af de gode ting ved agar – *de fleste* bakterier kan ikke spise det. I stedet giver agaren blot “stillads” til at huse de næringsstoffer, som bakterierne har brug for. Og ofte leveres disse næringsstoffer gennem et flydende bakterieføde-“vækstmedie” kaldet LB, som, uanset hvad der står i lærebøgerne, (oprindeligt i det mindste) står for Lysogeny Broth. Nogle gange får initialerne for Luria, Lennox eller Luria & Bertani æren for navnet, men det står i virkeligheden for LYSOGENY BROTH, og opskriften blev første gang offentliggjort (af Giuseppe Bertani) i 1951. Han brugte den, da han studerede lysogeni (en proces, hvor en bakterieinficerende virus kaldet en bakteriofag (“fage”) indsætter sit eget DNA i en bakteries DNA & venter på sin tid, indtil betingelserne er rigtige for at komme ind i den lytiske fage, hvor den skærer sig selv ud, laver masser af kopier og sprænger cellen) http://bit.ly/2HLuB1S
Pointen med LB er grundlæggende at give bakterierne det, de har brug for, for at vokse, dele sig og gøre det, vi ønsker (f.eks. lave kopier af DNA, vi sætter i dem, og/eller lave kopier af proteiner ved hjælp af instruktioner fra DNA, vi sætter i dem). Og at gøre det billigt.
Bemærk: Til proteinfremstilling og DNAfremstilling i stor skala dyrker vi bakterier i ren LB-væske – “i suspension” med rystning – men når vi skal isolere specifikke grupper af bakterier, der alle stammer fra den samme “modercelle” og dermed er genetisk identiske, indlejrer vi denne LB i en gel, så forskellige genetisk adskilte “kolonier” ikke blander sig, men i stedet vokser som klumpede prikker. Hvis du vil vide mere om forskellige medier til suspensionstinget kan du læse dette indlæg http://bit.ly/bacterialmedia, men i dag vil jeg fokusere på den gelindfangede form.
Vi giver ikke bakterierne et 5-stjernet køkken. I stedet ønsker vi at bruge så få penge som muligt, mens vi stadig giver dem de næringsstoffer, de har brug for. Som minimum skal vi give dem en energikilde, noget de kan nedbryde (katablere) for at lave ATP – sådanne ting kan være sukkerarter, proteiner, fedtstoffer. Ud over at nedbryde ting skal de være i stand til at lave ting som proteiner og DNA (lave den anabole del af stofskiftet). Dette kræver næringsstoffer, der leverer de nødvendige elementer som kulstof og kvælstof, som du heldigvis kan få med en simpel opskrift, der er tilstrækkelig til mange bakterier.
Der er 3 hovedkomponenter (selvom 2 af disse komponenter selv har en masse komponenter.
- TRYPTONE -> dette er en blanding af peptider dannet ved fordøjelsen af et protein kaldet kasein med pancreasenzym -> dette giver aminosyrer, som bakterierne kan bruge til at lave nye proteiner
- GYREEKSTRAKT -> dette “autolysat” af gær er i princippet bare det, der tilfældigvis var i gæren (organiske forbindelser, herunder vitaminer, sporstoffer osv.) – og hvis det var godt nok for gæren…
- SODIUM CHLORID (NaCl) (bordsalt) -> giver mulighed for osmotisk balance, transport osv.
Et par af de større LB-formuleringer er “Miller”, “Lennox”, & “Luria”-versionerne & de adskiller sig fra hinanden ved mængden af salt, de har. Miller & Bertani drukner bakterierne i NaCl (10g/L), mens Lennox kun bruger 5g/L og Luria kun 0,5g/L -> sådanne opskrifter med lavt saltindhold er gode, hvis man bruger et saltfølsomt antibiotikum. i den oprindelige artikel tilsatte Bertani også glukose, men de fleste senere opskrifter udelader det.
Og når vi nu taler om at udelade ting, skal vi sikre os, at vi “udelader” bakterier, som vi ikke ønsker, hvilket vi kan gøre ved at “selektere for” de bakterier, som vi ønsker, ved hjælp af selektionsmedier, som indeholder ting som antibiotika osv. der undertrykker væksten af de ting, som man ikke ønsker skal vokse. Når vi f.eks. sætter gener ind i bakterier, gør vi det normalt i form af cirkulære stykker DNA, der kaldes plasmider. Vi designer disse plasmider til også at have et antibiotikaresistensgen, så vi kan tilsætte det antibiotikum til fødevaren, og den kan stadig vokse, men andre ting kan ikke http://bit.ly/2tcW4ky
Der er også differentierede medier – det giver mulighed for “screening” i modsætning til “selektion” – man forhindrer ikke ting i at vokse, men man ændrer, hvordan de ser ud – f.eks, vi bruger X-gal til blå-hvid screening http://bit.ly/2MxNPs2
Når jeg sætter et plasmid med mit gen i bakterier og får kolonier, vælger jeg nogle få af disse kolonier og sætter dem i flydende LB (med antibiotika) for at vokse natten over for at lave masser af kopier af plasmidet, så kan jeg rense disse kopier ud og sende dem til sekventering for at kontrollere for skrivefejl, før jeg går ind i “ekspressionsforberedelsesdelen”.
Og uanset hvilket medie du bruger, skal det være sterilt. Så du autoklaverer det (stikker det i en rigtig varm højtryksopvaskemaskine) -> sørg for, at flaskerne ikke er tæt forseglet, ellers eksploderer de (heldigvis har jeg ikke begået denne fejl) – og lad være med at stramme lågene igen, før flaskerne er afkølet af, ellers sætter lågene sig fast (jeg *har* begået denne fejl). En anden fejl, man ikke må begå -> man må ikke tilsætte antibiotika før autoklavering, ellers inaktiverer man dem. Vi plejer ikke at tilsætte det før lige før vi er klar til at bruge det.
I undergrad lavede jeg alle mine egne medier, men her bruger vi så meget af det, at vi har en “mediemager” laboratorietekniker, som er fantastisk og laver & steriliserer vores bakterievækstmedier. Du ved, at noget har været igennem en autoklave, hvis linjerne på autoklavetapen er sorte – tapen er temperaturfølsom, så den skifter farve, når den bliver rigtig varm. Jeg har virkelig lyst til at designe en serie af autoklavetape med vittigheder og/eller trivia-beskeder – så hvis hele undervisningen ikke lykkes, har jeg vel en backup!
mere om emner nævnt (& andre) #365DaysOfScience Alle (med emner nævnt) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
