Microscopie is essentieel in vele aspecten van de mycologie. Zij heeft 3 belangrijke toepassingen:

1. Directe opsporing van schimmels in klinische specimens – de bijzondere verschijnselen kunnen zeer karakteristiek zijn voor bepaalde infecties, b.v. Zygomycete infectie of Indische inkt in cerebrospinaal vocht. Directe microscopie, indien positief, is sneller dan een kweek.
2. Bevestiging dat een kweek van een schimmel in de lucht, zoals Aspergillus, de oorzaak van de infectie is en waarschijnlijk geen contaminant.
3. Identificatie van schimmels, op basis van morfologische verschijningsvormen.

Het onderstaande gedeelte is vrij technisch en specifiek en geschreven voor de laboratoriummedewerker die de detectiepercentages en de rapportagevaardigheden wil verbeteren.

Deze tabel toont de belangrijkste monstertypes en bevindingen die voor directe microscopie worden gebruikt.

Monster	Detecteerbare schimmels en verschijningsvorm
CSF	Geesten van Cryptococcus	India-inktpreparaat.
Haar, nagels en huidschraapsel	Hyphae van dermatofyt of andere filamenteuze schimmels Geesten van Candida	Verschillende schimmels niet te onderscheiden. Culturen vaak negatief, dus microscopie alleen bewijs van infectie.
Slijm uit paranasale sinussen	Hyphae aantoonbaar in slijm is diagnostisch voor eosinofiele fungale rhinosinusitis	Mucus moet worden gefixeerd en gekleurd zoals voor histopathologische coupes. Hyphae kunnen ongrijpbaar zijn.
Oorresten/schraapsel	Hyphae, meestal met sporulerende koppen die typisch zijn voor Aspergillus niger.	Zo nu en dan vermengd met Candida- en gistcellen.
Corneaal schraapsel voor keratitis	Eesten of filamenteuze schimmels kunnen worden gezien	Hulpzaam vroeg teken van mycotische keratitis, maakt geen onderscheid tussen oorzakelijke soorten
Weefselaspiratie of biopsie	Hyphae van filamenteuze schimmels Gisten van Candida of andere gisten. Sferules van C. immitis	Sommige schimmels zeer kenmerkend, waaronder kleine gisten zonder hyphae die wijzen op C. glabrata, of niet-septate hyphae van een Zygomycete.
Respiratoire vloeistoffen	Gisten van geen betekenis Hyphae (zonder gisten) consistent met ziekte Pneumocystis jirovecii	Hyphae gewoonlijk septate en typisch voor Aspergillus, maar indien niet-gesepteerd, overweeg dan zygomycosis of mucormycosis. Imuunofluorescentie superieur voor P. jirovecii
Bloedfilm of beenmerg	Intracellulaire gisten typisch voor Histoplasma of zelden Penicillium	Een kenmerk van gedissemineerde histoplasmose en wordt in 40% aangetroffen.
Peritoneale vloeistof	Geesten of zelden hyphae	Hulpzaam bij het bevestigen van Candida peritonitis
Vaginale swab/uitstrijkje	Candida albicans (gisten en hyfen) of Candida glabrata	Keuze diagnostische test
Mycetoma korrel	Kan hyphae met kenmerken vertonen	Zij geven meestal geen uitsluitsel over de soort

Beschermingsmethodologie

Het oudste specifieke preparaat voor microscopie is een geconcentreerd (10-20%) kaliumhydroxideoplossing, die keratine zacht maakt en directe visualisatie van schimmels en enige morfologische evaluatie mogelijk maakt. Gramkleuren zijn minder gevoelig. Papanicolau-kleuring kan nuttig zijn. Cytologische objectglaasjes kunnen worden gekleurd met splinter- of Gomori Methenamine Silver (GMS)-kleuring. Immunofluorescentiemicroscopie is de beste methode om Pneumocystis op te sporen. Fluorescerende witmakers (Calcofluor, Blankophor of Tinopal UNPA-GX), die zich binden aan chitine in de schimmelcelwand, zijn een snelle manier om monsters te scannen op schimmelhyfae, en verbeteren de morfologische beoordeling.

De diagnostische rol van microscopie bij specifieke ziekten

CSF en meningitis

Ingekapselde Cryptococcuscellen kunnen vaak worden gedetecteerd in specimens van CSF of andere vloeistoffen of afscheidingen van de gastheer, aangebracht in Oost-Indische inkt. Ongeveer 50% van de HIV-negatieve en meer dan 80% van de HIV-positieve patiënten hebben een positief India-inkt onderzoek van de CSF. Met name intacte lymfocyten kunnen echter met het organisme worden verward. Bij personen met AIDS zijn Cryptococcus-cellen meestal overvloedig aanwezig in de CSF, hoewel de capsules klein kunnen zijn, wat herkenning moeilijk maakt. Aanhoudend positieve liquorbevindingen bij patiënten die worden behandeld, mogen alleen als bewijs van falen of terugval worden beschouwd als zij worden bevestigd door een verslechtering van de klinische toestand van de patiënt of door positieve kweken.

India-inktpreparaat van CSF toont meervoudige gisten met grote capsules, en smalle toppen naar kleinere dochtercellen, typisch voor C. neoformans

Transmissie-elektronenmicrografie van een C. neoformans-cel gezien in CSF bij een AIDS-patiënt met opvallend weinig kapsel aanwezig. Deze cellen kunnen worden aangezien voor lymfocyten.

Een filamenteuze schimmel in de CSF van een patiënt met meningitis die later Candida albicans in cultuur kweekte.

Haar

Specimens van de hoofdhuid moeten haarwortels, de inhoud van verstopte follikels en huidschilfers bevatten. Behalve favus, bevat het distale gedeelte van geïnfecteerd haar zelden enige schimmel. Om die reden zijn afgeknipte haren zonder wortels ongeschikt voor mycologisch onderzoek. Een methode die nuttig is voor het verzamelen van materiaal van de hoofdhuid is het nemen van haarborstelmonsters.

Direct microscopisch onderzoek van geïnfecteerd materiaal moet arthroconidia van de dermatofyt aantonen die zich buiten (ectothrix) of binnen (endothrix) de aangetaste haar bevinden. De arthroconidia kunnen zowel klein (2-4 um diameter) als groot (tot 10 um diameter) van omvang zijn. Huidschilfers bevatten hyphae en arthroconidia. Bij T. schoenleinii infectie (favus) worden losse ketens van arthroconidia en luchtruimten gezien binnen de aangetaste haren. Het scutulum (korst) bestaat uit mycelium, neutrofielen en epidermale cellen.

Schraapsel van de huid toont filamenteuze hyfen met blankophor.

Nagels

De kwaliteit van het genomen specimen is een belangrijke factor voor het al dan niet slagen van microscopie en kweek. De afname van een specimen moet pijnloos zijn, afgezien van een licht ongemak bij subunguale specimens. Onderstaande figuur toont de plaatsen waar nagelmonsters moeten worden genomen

Schraapsel dat met een bot scalpel is genomen of knipsels moeten in een gevouwen vierkant papier worden vervoerd, bij voorkeur vastgezet met een paperclip, maar er zijn ook in de handel verkrijgbare mycologische verpakkingen. In het laboratorium wordt 20-30% kaliumhydroxideoplossing toegevoegd aan een deel van het monster om het keratine van de nagel te macereren, zodat het monster met directe microscopie op schimmelelementen kan worden onderzocht. Een andere mogelijkheid is dat een deel van elk monster wordt onderzocht in een nageloplossende oplossing die een fluorochroom bevat. Een voorbeeld van een reactieve oplossing is deze. Deze wordt bereid door 1 g Na2S op te lossen in 7,5 ml gedestilleerd water en vervolgens 2,5 ml ethanol toe te voegen. Vervolgens wordt aan dit mengsel 10 ml Blankophor of 20 ml 1% waterige oplossing van Tinopal UNPA-GX (Fluorescerende witmaker 28, F3543; Sigma) toegevoegd.

Slijm uit neusbijholten

Een diagnostisch kenmerk van allergische schimmel rhinosinusitis (AFRS) is de aanwezigheid van eosinofiele slijmvliesbevattende hyfen, verzameld uit de neus of neusbijholten van de patiënt zonder bewijs van weefselinvasie door schimmel. Hyfen kunnen schaars zijn in de sinusinhoud en het kost veel tijd om ze te visualiseren met de momenteel gebruikte kleurstoffen. Zonder dit positieve kenmerk worden gewoonlijk andere diagnoses gesteld, waaronder allergische rhinosinusitis (ARS) of eosinofiele mucine rhinosinusitis (EMRS). Het gebruik van veel gevoeligere diagnostische technieken, zoals chitinekleuring of specifieke anti-Alternaria immunofluorescentiekleuring, kan de gevoeligheid echter verbeteren. Ondersteunende diagnostische kenmerken zijn de aanwezigheid van Charcot-Leyden-kristallen, benige erosie, en heterogene opaciteit met sinusuitzetting op CT-scan.

Oorheelkanaal en otitis externa

Afscheiding en afscheiding moeten worden verkregen uit de gehoorgang. Direct microscopisch onderzoek zal vertakkende hyphen, ontluikende gistcellen of beide aantonen. In gevallen van Aspergillus-infectie kunnen soms de typische sporende koppen worden gezien.

Corneale schraapsel voor keratitis

Schimmelkeratitis is een medisch noodgeval en moet onmiddellijk worden herkend en behandeld. Voor een microbiologische diagnose is het beste monster materiaal van het aangetaste deel van de cornea; het materiaal kan worden verzameld in de vorm van schraapsel van een ulcererend gebied of biopsie wanneer het corneale epitheel intact is en de infectie beperkt is tot het corneale stroma. Corneaschraapsel wordt verkregen met een instrument zoals een platina spatel, een Beaver mesje, een Bard Parker mesje nr.15 of een stomp cataractmes. Wattenstaafjes zijn minder doeltreffend om het necrotisch hoornvliesslijm te verwijderen. Materiaal moet herhaaldelijk worden verzameld van de basis en de randen van het verzweerde deel van de cornea. Als het materiaal op een steriel medium is gestrooid, kan hetzelfde mesje of spateltje opnieuw worden gebruikt om extra materiaal te verzamelen; als het materiaal echter in contact is gekomen met een niet-steriel objectglaasje, moet het mesje worden vervangen, terwijl de spatel kan worden gevlamd, gekoeld en vervolgens opnieuw gebruikt.

Direct microscopisch onderzoek van gekleurde uitstrijkjes van corneaschraapmateriaal is de snelste manier om een vermoedelijke diagnose te stellen. Septate hyaliene hyphae van filamenteuze schimmels kunnen Aspergillus, Fusarium of Acremonium vertegenwoordigen. Gekleurde septate hyfen van phaeohyphomyceten zoals Curvularia kunnen worden gezien. Soms is Candida spp. de oorzaak van keratitis en kunnen gisten en hyfagen worden gezien, wat op deze diagnose wijst. Confocale microscopie kan een directer middel zijn om de diagnose vast te stellen.

ab
a. corneaschraapsel met lactophenol katoenblauw toont afzonderlijke hyphae met Fusarium spp of Aspergillus spp. Dr Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Een ander hoornvliesafkrabsel gekleurd met lactophenol katoenblauw toont geparelde septate hyfen die niet typisch zijn voor Fusarium spp of Aspergillus spp, maar meer voor een dematiceuze (d.w.z. bruin gekleurde) schimmel

Weefsel en peritoneale vloeistoffen
De microscopische detectie van typische ontluikende gistcellen, pseudohyphae en/of echte hyphae van Candida-soorten in weefselcoupes of normaal steriele lichaamsvloeistoffen is een aanwijzing voor invasieve candidiasis. Gewoonlijk produceert C. glabrata alleen gistcellen en alleen C. albicans echte hyfen in weefsels

Gramkleuring van een gecentrifugeerde vloeistof (in dit geval urine) die C. albicans, waarop de gist- en hyfenvormen te zien zijn die zo vaak in dit soort specimen worden gezien.

Luchtwegstalen
Sputumonderzoek is nuttig bij ABPA omdat hyfen vaak kunnen worden gezien met eosinofielen en Charcot Leyden-kristallen. Soms kunnen ongewone schimmelinfecties worden gediagnosticeerd door microscopie wanneer sferules of grote gisten zoals Blastomyces dermatitidis worden gevisualiseerd. Aspergillus of andere filamenteuze hyfen kunnen worden gezien in bronchiaal spoelmateriaal van schimmel tracheobronchitis, soms met sporulerende koppen zichtbaar. Microscopie heeft een hogere opbrengst dan kweek bij invasieve pulmonale aspergillose uit BAL-monsters, in sommige centra afhankelijk van de gebruikte methode. Er zijn geen studies die de methoden voor microscopie of de opbrengst van schimmelkweken hebben vergeleken.

Slijmprop onderzocht met lichtmicroscopie met KOH, waarbij een netwerk van hyalien vertakkende hyfen te zien is dat typisch is voor Aspergillus, afkomstig van een patiënt met ABPA.

Hetzelfde preparaat van een BAL-exemplaar met hyaliene, septate hyfen die overeenkomen met Aspergillus, links gekleurd met Blankophor en rechts met KOH.

KOH-preparaat van een respiratoire vloeistof met brede niet-gesepteerde hyfen, typisch voor een Zygomycete.

Bloedfilm of beenmerg

De gevoeligheid van microscopie van bloed en beenmerg is voor de meeste schimmelinfecties niet hoog genoeg om de tijd die nodig is voor het onderzoek van de monsters te rechtvaardigen, met uitzondering van gedissemineerde histoplasmose en Penicillium marneffei, meestal bij AIDS.

Mycetoma korrels

De diagnose van mycetoma hangt af van de identificatie van korrels, die bij voorkeur met een steriele naald uit een ongerepte pustel (sinus) moeten worden verkregen. Het dak van de laesie moet worden opgetild en de inhoud van de sinus, met inbegrip van de korrels, moet worden uitgeknepen en op een glasplaatje worden gelegd. Elke korrel moet worden uitgezocht, gespoeld in alcohol 70% en vervolgens gewassen in steriele zoutoplossing alvorens te worden gekweekt. Direct microscopisch onderzoek van de korrels in 20% kaliumhydroxide bevestigt de diagnose mycetoma en maakt ook duidelijk of het oorzakelijke organisme een schimmel of een actinomycet is. Zwarte korrels wijzen op een schimmelinfectie; kleine witte korrels wijzen vaak op een Nocardia-infectie en grotere witte korrels ter grootte van een speldenknop kunnen zowel van schimmel- als van actinomycotische oorsprong zijn. Kleine, rode korrels zijn specifiek voor Actinomadura pelletieri, maar geelwitte korrels kunnen van actinomycotische of schimmeloorsprong zijn. Actinomycotische korrels bevatten zeer fijne filamenten (<1 um diameter), terwijl schimmelkorrels massa’s korte verstrengelde hyphen bevatten (2-4 um diameter) die soms gepigmenteerd zijn.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease: a guide to good practice (Verslag van een werkgroep van de British Society for Medical Mycology). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Direct mycologisch onderzoek in de dermatologie: een vergelijking van verschillende methoden. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Detection of Pneumocystis jiroveci in respiratory specimens by four staining methods. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.