1.4.3.2 Mosquitoes
Mosquitoes zijn vectoren van ernstige menselijke ziekten zoals malaria, knokkelkoorts en gele koorts, en ondanks inspanningen om ze te controleren blijven ze een ernstig probleem. Het identificeren van nieuwe genen van muggen die betrokken zijn bij olfactie, bloedvoeding, spijsvertering, voortplanting, immuniteit, enz., zal naar verwachting de basis leggen voor de ontwikkeling van nieuwe methoden om muggenpopulaties en door muggen overgebrachte ziekten te beheersen (Chen et al., De recente genoomsequentie-informatie voor drie belangrijke muggenvectoren, Anopheles gambiae, Aedes aegypti, en Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), is gebruikt voor vergelijkende genomica en transcriptionele profileringstudies die de identificatie van grote arrays van nieuwe muggengenen mogelijk maken. RNAi is snel uitgegroeid tot het instrument bij uitstek voor het karakteriseren van genfuncties in diverse gebieden van de muggenbiologie en muggen-pathogeen interacties (bijv. Fragkoudis et al., 2009). Dit heeft geresulteerd in de publicatie van een groot aantal functionele RNAi testen in deze groep organismen, waaronder leden van de aedines (A. aegypti, Armigeres subalbtus en C. pipiens) en anophelines (A. gambiae en Anopheles stephensi). De meeste van deze studies hebben zich echter op slechts twee soorten geconcentreerd: de belangrijkste vector van knokkelkoorts en gele koorts, A. aegypti, en de Afrikaanse vector van malaria, A. gambiae (tabel 1.1).
In deze studies, bestond de typische experimentele strategie uit micro-injectie van dsRNA in de thorax van volwassen muggen, gevolgd door voeding, uitdaging met pathogenen, geurstoffen, insecticiden of stress-omstandigheden, en het daaropvolgende onderzoek van de muggen om het fenotypische effect van de silencing van het doelgen op het bestudeerde fysiologische proces te analyseren, inclusief olfactie, voeding, spijsvertering en metabolisme, stress, ontgifting, cuticula vorming, voortplanting, immuniteit en diapauze regulatie. In het volgende presenteren we enkele representatieve studies van RNAi in muggen.
Olfactie medieert een breed scala van zowel volwassen als larvale gedragingen van muggen, waaronder voeding, gastheervoorkeur, locatie/selectie van de partner en broedplaatsen voor ovipositie. Olfactie omvat de perceptie van chemische stimuli door geurmoleculen en de ontwikkeling van specifieke reacties op zulke stimuli. Geurstoffen worden gevangen door geurstof-bindende eiwitten (OBP), die ze vervoeren naar de geurstof receptoren (OR) op de dendritische membranen van olfactorische neuronen. Recente RNAi targeting van zowel OBP en OR genen hebben waardevolle informatie over hun functie in de reuk mechanisme en specificiteit (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al,
In gematigde klimaten overwinteren volwassen vrouwtjesmuggen in diapause, een periode van rust die wordt gekenmerkt door de afwezigheid van gastheer-zoekgedrag, de accumulatie van enorme vetreserves en een stilstand van de ontwikkeling van de eierstokken. Manipulatie van de regulatie van deze rustperiode zou bijvoorbeeld kunnen resulteren in de inductie van slapende, niet-gastheer zoekende muggen. Dit is geïllustreerd in verschillende studies van Dr. Denlinger’s team. In het bijzonder hebben zij onlangs RNAi gebruikt om het diapauze mechanisme bij C. pipiens te onderzoeken, om de deelname van de insuline/FOXO signaalroute aan de regulatie van diapauze aan te tonen (Sim en Denlinger, 2008, 2009a). Zij hebben ook bewijs gevonden voor de betrokkenheid van sommige vetzuursynthasen bij de accumulatie van vetreserves in overwinterende wijfjes (Sim en Denlinger, 2009b), en voor de rol van ribosomale eiwitten S3 en S2 in de follikelontwikkeling bij niet-diapauzerende wijfjes (Kim en Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
Vitellogenese en voortplanting zijn ook gekarakteriseerd door RNAi bij muggen. Net als bij teken hebben anautogene muggen de inname van gewerveld gastheerbloed nodig om een voortplantingscyclus met eiproductie op gang te brengen. De aminozuren (AA) afkomstig van de bloedmaaltijd worden door het vetlichaam van de mug gebruikt om dooier-eiwitvoorlopers te synthetiseren, voornamelijk vitellogenine (Vg), in een proces dat vitellogenese wordt genoemd. Vg komt dan vrij in de hemolymfe en wordt opgenomen door de eierstokken en afgezet in zich ontwikkelende oöcyten via een specifieke VgR.
In de mug A. aegypti is de expressie van het Vg gen intensief bestudeerd door het team van Dr. Raikhel in een lange reeks elegante experimenten, waarin zij RNAi gebruikten als instrument voor omgekeerde functionele genomics. Dit team toonde aan dat de transcriptie van het Vg-gen strak gereguleerd wordt door de gecombineerde input van verschillende moleculen, waaronder de steroïdhormoon 20-hydroxyecdysone (20E) cascade en de voedings AA/Target-of-Rapamycin (TOR) signalering. Dit serine/threonine kinase is verantwoordelijk voor de transmissie van het AA-signaal en activeert de fosforylering van S6-kinase, die vereist is voor de activering van de translatie (Park et al., 2006; Roy en Raikhel, 2011). Bovendien heeft hetzelfde team, door injectie van een specifiek antagomir, RNAi-gemedieerde depletie van het miRNAi miR-27 bewerkstelligd om de functie van miR-27 als positieve regulator in zowel de bloedvertering als de ei-ontwikkeling aan te tonen. In feite wordt miR-27 als zodanig gereguleerd door de 20E en AA/TOR pathways (Bryant et al., 2010).
Het aangeboren immuunsysteem van muggenvectoren omvat drie functionele categorieën van genen die betrokken zijn bij pathogeenherkenning, signaaltransductieroutes die signaalversterking, -modulatie en -transductie mediëren en effectormechanismen die pathogeenverwijdering uit de gastheer mediëren (Baton et al., 2008). RNAi is zelf een belangrijk antiviraal immuunmechanisme bij muggen. Bij op RNA gebaseerde antivirale immuniteit wordt viraal dsRNA door de mug Dicer herkend en verwerkt tot siRNAs. Daarna leiden deze van het virus afgeleide siRNA’s de specifieke antivirale immuniteit door middel van RNAi en verwante RNA silencing effectormechanismen (Ding, 2010). Talrijke papers rapporteren over het gebruik van RNAi om de functie van mosquito immuungenen te karakteriseren. Studies over algemene immuunmechanismen en -effectoren hebben zich geconcentreerd op patroonherkenningsreceptoren, antibacteriële en antischimmel signaalwegmoleculen en eiwitten die betrokken zijn bij andere cellulaire effectormechanismen (besproken in Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
RNAi is ook gebruikt bij de karakterisering van de interface tussen mug en pathogeen, waarbij veel onderzoeken betrekking hebben op immuungerelateerde muggenmoleculen. Moleculaire interacties op het grensvlak tussen mug en ziekteverwekker zorgen voor overleving en ontwikkeling van zowel de ziekteverwekker als de vector. Daarom is het begrijpen van de moleculaire interacties tussen ziekteverwekkers en hun muggenvectoren van fundamenteel belang voor de ontwikkeling van nieuwe controlemaatregelen. In de afgelopen tien jaar is er veel onderzoek gedaan naar de identificatie en functionele karakterisering van muggengenen die betrokken zijn bij pathogeen-geïnduceerde immuunreacties. Daarbij is gebruik gemaakt van verschillende benaderingen, waaronder vergelijkende genomica, transcriptionele profilering en op RNAi-gebaseerde functionele analyse (Baton et al., 2008). Deze inspanningen zijn voornamelijk gericht op twee associaties van muggen en pathogenen, A. gambiae-Plasmodium sp. en A. aegypti-dengue virus 2 (DENV-2). De aangeboren immuunresponsen van muggen op arbovirusinfectie zijn in detail besproken door Fragkoudis et al. (2009), en die op malariaparasieten zijn recent besproken door Brown en Catteruccia (2006) en Baton et al. (2008), met inbegrip van RNAi-benaderingen.
De meeste van deze op RNAi-gebaseerde studies hebben zich gericht op genen van de afweermechanismen van muggen in plaats van op genen die pathogenen nodig hebben om zich in de muggenvector te ontwikkelen. De meeste van de antimalariageengenen van de muggen die door RNAi zijn uitgeschakeld, zijn betrokken bij het doden van ookineten en bij de melanisatie tijdens de penetratie in het middenrif (besproken in Brown en Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). Wat betreft de antivirale mosquito genen die zijn onderworpen aan knock-down, zijn sommige componenten van signaalwegen, terwijl andere deel uitmaken van de RNAi-gebaseerde antivirale verdediging (besproken in Fragkoudis et al., 2009).
Een van de meest recente artikelen, Guo et al. (2010) presenteren een nuttige benadering om nieuwe A. aegypti eiwitten te identificeren die interageren met DENV-2. Deze auteurs ontwikkelden het eerste ontwerp van het mosquito eiwit interactienetwerk met behulp van een computationele aanpak en identificeerden 714 vermoedelijke DENV-geassocieerde A. aegypti eiwitten die gegroepeerd zijn in vier belangrijke functionele categorieën (replicatie/transcriptie/translatie, immuniteit, transport en metabolisme). Tien van deze vermoedelijke DENV-geassocieerde eiwitten werden willekeurig geselecteerd voor validatie door RNAi-gemedieerde gen silencing, en dengue virale titer in muggenmidden ingewanden werd significant verminderd voor vijf van hen.
Collectief ondersteunen deze resultaten het idee dat RNAi een krachtig hulpmiddel zou kunnen zijn voor high-throughput karakterisering van het immuunsysteem van vectoren van insectenziekten, waarmee een bijdrage wordt geleverd aan de identificatie en karakterisering van potentiële muggendoelen voor de ontwikkeling van nieuwe methoden om muggenpopulaties, parasieten in muggen en door muggen overgebrachte ziekten te beheersen.
Na de ontdekking dat RNAi een van de belangrijkste verdedigingsmechanismen van de mug tegen arbovirussen is, is gemeld dat onderdrukking van deze pathway de virale belasting in geïnfecteerde muggen verhoogt (Sanchez-Vargas et al, 2009). Cirimotich et al. (2009) gebruikten een Sindbis virus dat een eiwit tot expressie brengt dat zich bindt aan dsRNA en het vermoedelijk beschermt tegen verwerking in de RNAi pathway, waardoor het als een RNAi suppressor optreedt. Dit gemanipuleerde virus produceert veel meer virusdeeltjes dan normaal in geïnfecteerde muggen en is dodelijk voor een reeks muggensoorten (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Deze benadering is een voorbeeld van een nieuwe, op genetica gebaseerde ontwikkeling, die potentieel nuttig is in “populatieonderdrukkings”-strategieën voor muggencontrole (Alphey, 2009).
Het tegenovergestelde doel, namelijk het kunstmatig opvoeren van op RNAi gebaseerde antivirale immuniteit van muggen om virusresistente muggen te verkrijgen, is ook ontwikkeld. Antivirale RNAi is gebruikt om resistentie tegen DENV te verlenen in transgene A. aegypti muggen, door expressie van een haarspeld RNA dat overeenkomt met een fragment van het virus (Franz et al., 2009). Door gebruik te maken van weefsel- en tijdspecifieke promotors kan de expressie van haarspeld RNA beperkt worden tot de middendarm – de eerste cellen die geïnfecteerd worden – en alleen na de bloedmaaltijd, waardoor potentiële problemen voor de conditie van de mug als gevolg van de constitutieve expressie van een lang-haarspeld RNA geminimaliseerd worden. Een discussie over de voordelen en problemen van het gebruik van dit soort transgene resistente muggenstammen in ‘populatievervangende’ strategieën voor muggencontrole kan worden gevonden in Alphey (2009).