Formaldehydfixeringsmedel

Information om 37 % formaldehyd

Det finns ingen bestämd ålder efter vilken 37 % formaldehyd inte längre är användbart som lagerlösning. Formaldehydkemin är måttligt komplex, men efter diskussioner med andra mikroskopister, tillverkare och genomgång av relevanta texter är följande observationer tillämpliga.

• Formaldehyd bör förvaras i rumstemperatur (kalla temperaturer uppmuntrar till bildning av trioximetylen med en resulterande vit utfällning)
• Formaldehyd bör förvaras tättslutande, eftersom exponering för luft uppmuntrar oxidation av formaldehyd till myrsyra (37% formaldehyd levereras vanligen med 10-15% metanol för att hämma denna förändring).

Vår rekommendation om 37-procentiga lagerlösningar: Om en lösning av 37 % formaldehyd är klar, färglös och inte har någon utfällning, och har förvarats i rumstemperatur i en tätt försluten flaska som inte har utsatts för solljus, bör den vara bra, men vi rekommenderar ändå inte att man använder en lagerflaska som är äldre än 1 år. Flaskor med 37 % formaldehyd som redan är öppnade bör inte användas mer än sex månader. Följaktligen rekommenderar vi att laboratorierna köper sin formaldehyd oftare och i mindre mängder än vad de kanske har gjort tidigare.

Användning av 37 % formaldehyd rekommenderas inte för fixeringsmedel för elektronmikroskopi. Antingen en högre kvalitet, metanolfri formaldehyd eller en färsk lösning gjord av paraformaldehyd är ett mycket bättre val (se vidare kommentarer nedan).

Information om 10 % formalin

Fixeringsmedlet 10 % buffrat formalin används vanligen för att konservera vävnader för rutinhistologi i många laboratorier. Formaldehydet har större chans till oxidation i denna koncentration av vävnadsfixeringsmedel och så småningom kommer lösningen att börja sjunka i pH, trots bufferten. Vi rekommenderar att 10 % buffrade formalinlösningar inte används längre än tre månader efter att de först blandades. Lösningen bör vara klar, färglös, utan utfällning och pH bör inte understiga 6,5.

Det andra problemet med 10 % buffrat formalin är den långsamt ökande koncentrationen av metanol (en oönskad biprodukt av åldrande formaldehyd). Metanol främjar klumpning av proteiner, i stället för den tvärbindning av proteiner som formaldehyd utför. Ett metanolfritt fixeringsmedel ger bäst bevarande, särskilt om du planerar att använda vävnaden för antikroppsfärgning vid ett senare tillfälle.

Det vanligaste sättet att undvika metanol i en formaldehydlösning är att göra upp lösningen färsk av kristallin paraformaldehyd. Paraformaldehyd kan vara ganska farligt att hantera och det är ofta svårt att få det att gå i lösning. Om ditt labb inte är en regelbunden användare av formaldehydfixeringsmedel finns det ett par enklare alternativ som vi rekommenderar.

Ett alternativ är att köpa metanolfri formaldehyd (aq) i förseglade ampuller. Tillsätt helt enkelt PBS för att uppnå rätt formaldehydkoncentration och använd omedelbart. Tio 10 ml ampuller med 16 % metanolfri formaldehyd kostar ungefär 27 dollar.

Det andra alternativet är att köpa 10 % neutralt buffrad formalin (4 % formaldehyd) från ett vetenskapligt förråd, använda det i 3-6 månader och sedan kasta det (som ett farligt material). Det kommer att finnas en del metanol i denna lösning (vanligtvis 1-2 %), men om den används snart efter köpet bör detta inte vara betydande för de flesta användare. Den buffrade lösningen hjälper till att bromsa försurningsprocessen. En flaska på en liter kostar ungefär 20-25 dollar. Förvara fixeringsmedlet vid rumstemperatur. Lokala läsare av denna sida bör kontakta CMM Histology Service Lab (626-4415) om de har svårt att hitta en leverantör. (Observera att olika leverantörer använder olika buffertlösningar. För konsekvent immunohistokemi och/eller immunofluorescens bör användarna hålla sig till en leverantör).

Vissa laboratorier har frågat om man kan använda 10 % formalin utan buffert. Om det inte finns en särskild anledning till detta val rekommenderar vi det inte eftersom detta fixeringsmedel snabbt blir surt. Förvaring av vävnad i detta fixeringsmedel längre än flera timmar bör starkt avrådas.

Rekommendationer för optimal fixering av prover

Vävnadsprover bör placeras i fixeringsmedel så snabbt som det är rimligt efter det att de avlägsnats från djuret, fixeringsmedlet bör vara minst 20 gånger vävnadens volym och fixeringsmedlet bör bytas ut efter den första timmen av fixering.

Vävnaden bör skäras så att den tunnaste dimensionen inte är större än 4-5 mm i tjocklek (formalinpenetrationen är långsam, ca 0,5 mm/timme). Detta motsvarar ungefär tjockleken på två US quarters. Om vävnaden eller organet har en tjock kapsel (t.ex. njure) bör användarna vara medvetna om att fixeringsmedlet inte tränger igenom kapseln lika snabbt. Alltför tjocka prover kan bli överfixerade på utsidan och dåligt fixerade på insidan, vilket orsakar tolkningsproblem på grund av färgningsartefakter.

Den inledande fixeringen bör ske vid rumstemperatur eftersom formalinets penetration är relaterad till lösningens temperatur. Formalin bör skakas försiktigt före användning för att undvika en koncentrationsgradient i flaskan.

Fixeringstiden beror till viss del på vävnadens tjocklek.

• Monolager av odlade celler behöver inte fixeras länge, typiskt sett räcker 15-30 minuter. Odlade celler bör gå från fixering till det protokoll som användarens laboratorium använder för immunohistokemi/immunofluorescens.
• Vävnader och organ bör fixeras (beroende på deras storlek) i 2 timmar till högst 24 timmar. Därefter kan vävnaderna förvaras under korta perioder (helst inte mer än 3 dagar) i 70 % etanol (aq). Längre förvaring i någon av lösningarna kan leda till att vävnaden blir alltför hård och leder till svårigheter att sektionera paraffinblocken.

Men noggrant följa ett standardiserat fixeringsprotokoll kommer att leda till de mest konsekventa resultaten.

Formalin vs. formaldehyd

Vi har emellanåt stött på en viss förvirring om skillnaden mellan formaldehyd och formalin. Detta är ett förståeligt problem, eftersom termerna ibland används omväxlande. Det är felaktigt att använda de två orden på detta sätt. De koncentrationer av kemiska fixeringsmedel som de två namnen representerar är helt olika.

Ett fixeringsmedel som märks som 10 % buffrat formalin är i själva verket bara en 4 % lösning av formaldehyd. Detta beror på att 10 % buffrat formalin är ett exempel på gammal histologjargong som beskriver en 10 % lösning gjord av en lagerflaska med 37-40 % formaldehyd (eller mer exakt: en 3,7-4 % lösning av formaldehyd).

Säkerhet vid formaldehyd

USA:s arbetarskydds- och hälsoskyddsmyndighet (OSHA) är mycket oroad över formaldehyd. Om du inte har ett aktuellt säkerhetsdatablad (MSDS) för formaldehyd i ditt labb kan du hitta ett i SIRI:s MSDS-arkiv.

Vänligen var medveten om riskerna med formaldehyd. Följande uttalande kommer från ett säkerhetsdatablad för 10 % buffrat formalin:

“DANGER! KAN VARA DÖDLIGT OM DET SVÄLJS. SKADLIGT OM DET ANDAS IN ELLER ABSORBERAS GENOM HUDEN. FÖRORSAKAR IRRITATION AV HUD, ÖGON OCH LUFTVÄGAR. STARKT SENSIBILISERANDE. KAN ORSAKA BLINDHET. BRÄNNBAR VÄTSKA OCH ÅNGA. MISSTÄNKT CANCERRISK. INNEHÅLLER FORMALDEHYD SOM KAN ORSAKA CANCER. Risken för cancer beror på varaktighet och exponeringsnivå.”

(för lokala läsare) University of Arizona Department of Risk Management har ett självstudieprogram som heter “Hazard Communication Training for Formaldehyde”. Denna guide kommer att introducera dig till alla relevanta aspekter av OSHA:s formaldehydstandard från 1992. Enligt Risk Management “krävs årlig utbildning för personer som använder formaldehydlösningar på mer än 0,1 % eller material som kan avge mer än 0,1 ppm formaldehyd”. Detta skulle inkludera de flesta av oss som använder formaldehyd för fixeringsmedel för histologi eller elektronmikroskopi.

För att få ett exemplar av “Hazard Communication Training for Formaldehyde” handout, vänligen kontakta Dept. of Risk Management and Safety direkt (621-1570, University of Arizona fakultet, personal och studenter endast).

▲ överst på sidan