Mikroskopi är viktigt för många aspekter av mykologi. Den har tre huvudsakliga användningsområden:

1. Detektion av svampar direkt i kliniska prover – de särskilda utseendena kan vara mycket karakteristiska för vissa infektioner, t.ex. zygomycetinfektion eller India Ink i cerebrospinalvätska. Direktmikroskopi är, om den är positiv, snabbare än odling.
2. Bekräftelse av att en odling av en luftburen svamp, t.ex. Aspergillus, är orsaken till infektionen och inte troligen är en kontaminant.
3. Identifiering av svampar, baserat på morfologiska utseenden.

Avsnittet nedan är ganska tekniskt och specifikt och skrivet för laboratoriearbetaren som vill förbättra detektionsfrekvensen och rapporteringsförmågan.

Denna tabell visar de viktigaste provtyperna och fynden som används för direktmikroskopi.

Prov	Svampar som kan påvisas och utseende
CSF	Yeasts of Cryptococcus	India Ink preparation.
Hår-, nagel- och hudskrap	Hyfer av dermatofyter eller andra trådformiga svampar Yeaster av Candida	Olika svampar går inte att skilja åt. Odlingar är ofta negativa, så mikroskopi är endast bevis på infektion.
Slemhinnor från paranasala bihålor	Hyphae som kan påvisas i slemhinnor är diagnostisk för eosinofil svamprhinosinusit	Slemhinnor bör fixeras och färgas som för histopatologiska snitt. Hyphaer kan vara svårfångade.
Öronrester/skrapning	Hyphaer, vanligen med sporulerande huvuden typiska för Aspergillus niger.	Undertiden blandat med Candida och jästceller.
Korneal skrapning för keratit	Jeasts eller filamentösa svampar kan ses	Hjälpsamt tidigt tecken på mykotisk keratit, skiljer inte mellan orsakande arter
Vävnadsaspiration eller biopsi	Hyfer av filamentösa svampar Yeasts av Candida eller andra jästsvampar. Sfärer av C. immitis	Vissa svampar är mycket distinkta, bland annat små jästsvampar utan hyfer som tyder på C. glabrata, eller icke-septata hyfer av en zygomycete.
Respiratoriska vätskor	Hyfer utan betydelse Hyfer (utan jäst) som är förenliga med sjukdom Pneumocystis jirovecii	Hyferna är vanligen septade och typiska för Aspergillus, men om de inte är septiska bör man överväga zygomykos eller mukormykos. Imuunofluorescens överlägsen för P. jirovecii
Blodfilm eller benmärg	Intracellulära jästsvampar typiska för Histoplasma eller sällan Penicillium	Ett kännetecken för disseminerad histoplasmos och hittas i 40%.
Peritonealvätska	Jeasts eller sällan hyfer	Hjälplig vid bekräftelse av Candida. peritonit
Vaginalsvab/-mål	Candida albicans (jäst och hyfer) eller Candida glabrata	Nyckel diagnostiskt test
Mycetoma korn	Kan visa hyfer med egenskaper	Oftast inte definitivt med avseende på art

Hållningsmetodik

Det äldsta specifika preparatet för mikroskopi är en koncentrerad (10-20 %) kaliumhydroxidlösning, som mjukar upp keratin och möjliggör direkt visualisering av svampar och viss morfologisk utvärdering. Gramfärgningar är mindre känsliga. Papanicolau-färgningar kan vara användbara. Cytologiska objektglas kan färgas med sliver- eller Gomori Methenamine Silver (GMS)-färgningar. Immunofluorescensmikroskopi är den bästa metoden för att påvisa Pneumocystis. Fluorescerande ljusare ämnen (Calcofluor white, Blankophor eller Tinopal UNPA-GX), som binder till chitin i svampens cellvägg, är ett snabbt sätt att skanna prover för att hitta svamphyfer och förbättrar morfologibedömningen.

Mikroskopins diagnostiska roll vid specifika sjukdomar

CSF och hjärnhinneinflammation

Inkapslade Cryptococcus-celler kan ofta påvisas i prover av CSF eller andra värdvätskor eller sekret som monterats i tusch. Ungefär 50 % av hiv-negativa och mer än 80 % av hiv-positiva patienter har en positiv India ink undersökning av CSF. Särskilt intakta lymfocyter kan dock förväxlas med organismen. Hos personer med aids finns det vanligen gott om Cryptococcus-celler i CSF, även om kapslarna kan vara små, vilket gör det svårt att känna igen dem. Ihållande positiva CSF-fynd hos patienter under behandling bör betraktas som bevis på misslyckande eller återfall endast om de bekräftas av en försämring av patientens kliniska tillstånd eller av positiva odlingar.

Indianbläckpreparat av CSF som visar flera jästsvampar med stora kapslar och smala knoppar till mindre dotterceller, typiska för C. neoformans

Transmissionselektronmikroskopisk bild av en C. neoformans-cell som setts i CSF hos en aidspatient med anmärkningsvärt liten kapsel närvarande. Dessa celler kan misstas för lymfocyter.

En filamentös svamp i CSF hos en patient med meningit som senare odlade Candida albicans i odling.

Hår

Prover från hårbotten bör inkludera hårrötter, innehållet i pluggade folliklar och hudskikt. Med undantag för favus innehåller den distala delen av infekterat hår sällan någon svamp. Av denna anledning är avklippta hårstrån utan rötter olämpliga för mykologiska undersökningar. En metod som är användbar för att samla in material från hårbotten är provtagning med hårborste.

Direkt mikroskopisk undersökning av infekterat material bör avslöja arthrokonidier från dermatofyten som är belägna utanför (ectothrix) eller inuti (endothrix) det angripna håret. Arthrokonidierna kan vara antingen små (2-4 um i diameter) eller stora (upp till 10 um i diameter). Hudskallar kommer att innehålla hyfer och arthrokonidier. Vid T. schoenleinii-infektion (favus) ses lösa kedjor av arthrokonidier och luftrum i de angripna hårstråna. Scutulum (skorpan) består av mycel, neutrofiler och epidermala celler.

Hudskrapning som visar filamentösa hyfer med blankophor.

Naglar

Kvaliteten på det tagna provet är en viktig faktor för framgång eller inte vid mikroskopering och odling. Att få ett prov taget ska vara smärtfritt bortsett från enstaka lätt obehag när subunguala prover tas. Figuren nedan visar de lämpliga ställen från vilka nagelprover bör tas

Skrapningar tagna med en trubbig skalpell eller klippningar bör transporteras i en vikt papperskvadrat, företrädesvis fäst med en pappersklämma, men kommersiella mykologiska förpackningar finns också att tillgå. I laboratoriet tillsätts 20-30 % kaliumhydroxidlösning till en del av provet för att macerera nagelkeratinet så att provet kan undersökas för svampelement genom direktmikroskopi. Alternativt undersöks en del av varje prov i nagelupplösningslösning som innehåller en fluorokrom. Ett exempel på en reaktiv lösning är denna. Den framställs genom att 1 g Na2S löses upp i 7,5 ml destillerat vatten och därefter tillsätts 2,5 ml etanol. Därefter tillsätts 10 ml Blankophor eller 20 ml 1 % vattenlösning av Tinopal UNPA-GX (Fluorescent brightener 28, F3543; Sigma) till denna blandning.

Slem från bihålorna

Ett diagnostiskt kännetecken för allergisk svamprhinosinusit (AFRS) är närvaron av eosinofila mucinhaltiga hyfer som samlats in från patientens näsa eller bihålor utan tecken på vävnadsinvasion av svamp. Hyferna kan vara sparsamma i sinusinnehållet och tar avsevärd tid att visualisera med de för närvarande använda färgämnena. Utan denna positiva egenskap ställs vanligen andra diagnoser, bland annat allergisk rhinosinusit (ARS) eller eosinofil mucinrhinosinusit (EMRS). Användningen av mycket känsligare diagnostiska tekniker, t.ex. chitinfärgning eller specifika anti-Alternaria-immunofluorescensfärgningar, kan dock förbättra känsligheten. Stödjande diagnostiska kännetecken är förekomst av Charcot-Leyden-kristaller, benerosion och heterogen opacitet med sinusutvidgning på datortomografi.

Hörselgången och otitis externa

Debris och sekret bör tas från hörselgången. Direkt mikroskopisk undersökning kommer att avslöja förgrenade hyfer, knoppande jästceller eller båda. I fall av Aspergillus-infektion kan man ibland se de typiska sporingskopparna.

Cornealskrapning vid keratit

Svampkeratit är en medicinsk nödsituation som måste uppmärksammas och behandlas omgående. För mikrobiologisk diagnos är det bästa provet material från den drabbade delen av hornhinnan; materialet kan samlas in i form av skrap från ett ulcererat område eller biopsi när hornhinneepitelet är intakt och infektionen är begränsad till hornhinnans stroma. Skrapningar av hornhinnan tas fram med hjälp av ett instrument, t.ex. en platinaspatel, Beaver-blad, Bard Parker-kniv nr 15 eller en trubbig kataraktkniv. Bomullstops är mindre effektiva när det gäller att avlägsna den nekrotiska hornhinnan. Material bör samlas in från basen och kanterna av den såriga delen av hornhinnan upprepade gånger. Om materialet har strimlats på ett sterilt medium kan samma blad eller spatel användas igen för att samla in ytterligare material; men om materialet har kommit i kontakt med ett icke-sterilt objektglas måste bladet bytas ut medan spateln kan flammas, kylas och sedan återanvändas.

Direkt mikroskopisk undersökning av färgade utstryk av hornhinneskrapmaterial är det snabbaste sättet att ställa en presumtiv diagnos. Septata hyalina hyfer av filamentösa svampar som ses kan representera arter av Aspergillus, Fusarium eller Acremonium. Färgade septatala hyfer av phaeohyphomyceter, t.ex. Curvularia, kan ses. Ibland är Candida spp. orsaken till keratit och då kan jäst och hyfer ses, vilket tyder på denna diagnos. Konfokal mikroskopi kan vara ett mer direkt sätt att fastställa diagnosen.

ab
a. hornhinneskrap med laktofenol bomullsblått visar separata hyfer med Fusarium spp eller Aspergillus spp. Dr Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Ett annat hornhinneskrap färgat med laktofenol bomullsblått visar pärlformade septatala hyfer som inte är typiska för vare sig Fusarium spp eller Aspergillus spp, utan mer förenliga med en dematiceös (dvs. brunfärgad) svamp

Vävnad och peritonealvätskor
Den mikroskopiska påvisningen av typiska knoppande jästceller, pseudohyphaer och/eller äkta hyfer av Candida-arter i vävnadssektioner eller normalt sterila kroppsvätskor är ett tecken på invasiv candidiasis. Typiskt sett producerar C. glabrata endast jästceller och endast C. albicans producerar riktiga hyfer i vävnader

Gramfärgning av en centrifugerad vätska (i detta fall urin) som innehåller C. glabrata och C. albicans. albicans, som visar jäst- och hyferformerna, som så ofta ses i denna typ av prov.

Avluftningsprov
Sputumundersökning är till hjälp vid ABPA eftersom hyfer ofta kan ses tillsammans med eosinofiler och Charcot Leyden-kristaller. Ibland kan ovanliga svampinfektioner diagnostiseras genom mikroskopi när sfärer eller stora jästsvampar som Blastomyces dermatitidis visualiseras. Aspergillus eller andra filamentösa hyfer kan ses i bronkialsköljmaterial från svampig trakeobronchit, ibland med sporulerande huvuden synliga. Mikroskopi har ett högre utbyte än odling vid invasiv pulmonell aspergillos från BAL-prov, i vissa centra beroende på vilken metod som används. Inga studier har jämfört metoder för mikroskopi eller svampodlingsutbyte.

Slemhinnepropp undersökt med ljusmikroskopi med KOH, som visar ett nätverk av hyalina förgrenade hyfer typiska för Aspergillus, från en patient med ABPA.

Samma preparat av ett BAL-prov som visar hyalina, septatformade hyfer som är typiska för Aspergillus, färgat med Blankophor till vänster och KOH till höger.

KOH-preparat av en respiratorisk vätska som visar breda icke-septata hyfer, typiska för en Zygomycete.

Blodfilm eller benmärg

Känsligheten för mikroskopi från blod och benmärg är inte tillräckligt hög för de flesta svampinfektioner för att rättfärdiga tiden som går åt till att undersöka proverna, med undantag för disseminerad histoplasmos och Penicillium marneffei, vanligen vid AIDS.

Mycetomkorn

Diagnosen av mycetom beror på identifiering av korn som helst ska tas från en obruten pustel (sinus) med hjälp av en steril nål. Läsionens tak bör lyftas av och sinusinnehållet, inklusive eventuella korn, pressas ut och placeras på ett glasobjektsglas. Varje korn ska plockas ut, sköljas i 70-procentig alkohol och sedan tvättas i steril saltlösning innan det odlas. Direkt mikroskopisk undersökning av kornen i 20 % kaliumhydroxid bekräftar diagnosen mycetom och avslöjar också om den orsakande organismen är en svamp eller en aktinomycet. Svarta korn tyder på en svampinfektion, små vita korn tyder ofta på en Nocardiainfektion och större vita korn som är lika stora som ett knappnålshuvud kan vara av antingen svamp- eller aktinomykotiskt ursprung. Små, röda korn är specifika för Actinomadura pelletieri, men gulvita korn kan vara av aktinomykotiskt eller svampigt ursprung. Aktinomykotiska korn innehåller mycket fina trådar (<1 um i diameter), medan svampkorn innehåller massor av korta sammanflätade hyfer (2-4 um i diameter) som ibland är pigmenterade.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease: a guide to good practice (rapport från en arbetsgrupp inom British Society for Medical Mycology). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Direct mycological examination in dermatology: a comparison of different methods. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Påvisande av Pneumocystis jiroveci i respiratoriska prover med fyra färgningsmetoder. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.

.