Bakteeripesäkkeiden kasvattamisessa LB-agar nousee levylle – mutta ensin se on saatava geelimäiseen tilaan (tilanteeseen, johon sen ystävä agaroosi voi varmasti samaistua).) “-ose” on pääte, jota käytetään yleensä osoittamaan, että jokin on sokeri – ja agaroosi on sokeri – mutta niin on myös agar! Mikä on siis ero? Ne ovat sukua, mutta ne eroavat toisistaan muillakin kuin vain muutamalla kirjaimella, ja nämä erot tekevät niistä käyttökelpoisia tehtäessä geelimatriiseja erilaisiin tehtäviin – agaroosigeelit DNA-fragmenttien erottamiseen koon mukaan ja agar-geelilevyt bakteerien kasvattamiseen)
A gar on kalan kaltainen olento, ja AGAR (eli agar-agar (vakavasti puhuen!)) on seos, joka koostuu kahdesta sokerista – agaropektiini- eli agaropektiini- eli agaropektiini- eli agaroosiasteesta, & se yksi, joka on tuttavallisempi, eli agaroosi. Agaroosia saadaan siis puhdistamalla agaria. Ja jotta ymmärtäisi, miksi joskus näkee tuon vaivan, mutta toisinaan ei, on hyödyllistä tietää hieman enemmän siitä, mitä nämä sokerit ovat.
Agaroosi on polysakkaridi (“poly” tarkoittaa monia & sakkaridin sokereita, joten polysakkaridi on pitkä ketju toistuvia, toisiinsa liitettyjä sokerin alayksiköitä). Se on esimerkki polymeeristä. Polymeerit ovat pitkiä toistuvien alayksiköiden ketjuja. Eri polymeereissä on erityyppisiä alayksiköitä (esim. nukleotidien alayksiköt liittyvät toisiinsa muodostaen DNA:ksi tai RNA:ksi kutsuttuja polymeerejä; aminohapot liittyvät toisiinsa muodostaen proteiineja; ja monosakkaridisokerit ketjuuntuvat toisiinsa muodostaen monimutkaisia hiilihydraatteja (kuten agaroosia)!))
Sokerissa on paljon hydroksyyliryhmiä (-OH) (joihin vesi tarttuu mielellään, mikä auttaa sinua muodostamaan geelin – “äärettömän” toisiinsa kytkeytyneen (kuten 7° Kevinin pekonia) polymeeriverkon, joka sisältää vettä. (lisää tulossa)). Yksittäiset sokeriyksiköt (monosakkaridit) omaksuvat usein rengasrakenteita (kuten agaroosissa), joissa -OH-ryhmät työntyvät ulos kuin jalat. Sokerilla voi olla sama “linkitys”, mutta linkitetyt ryhmät voivat työntyä ulos eri tavoin & käytämme “L”- ja “D”-merkkejä viittaamaan siihen, mihin suuntaan avaruudessa jalat osoittavat. Lisää tällaisesta stereokemiasta täällä: bit.ly/2Q8Dnax
Monosakkaridit voivat linkittyä toisiinsa -OH:n avulla. Linkittämällä 2 saadaan disakkaridi . Lisäämällä muutama lisää saat oligosakkarideja (oligo tarkoittaa muutamia). Jos yhdistät paljon, saat polysakkaridin (poly tarkoittaa monta).
Ja monista puhuttaessa useat -OH:t tarkoittavat, että mahdollisia linkityskohtia on useita (jotka määritetään sillä, kuinka monta “osoitetta” sokerirenkaissa on yhdistetty). Voit saada “haarautumista”, mutta agaroosissa on lineaarisia ketjuja (noin 400 alayksiköstä). (Tosin haaroja voidaan tuoda käyttämällä “ristisilloitusaineita” agaroosin vahvistamiseksi, jotta sillä voidaan tehdä asioita, kuten valmistaa koon poissulkevaa kromatografiahartsia (“geelisuodatus”), joka kestää FPLC:ssä (Fast performance liquid chromatography, nopean suorituskyvyn nestekromatografia) syntyviä korkeita paineita.
Agaroosissa toistuva alayksikkö on sokerikaksikko (disakkaridi) galaktoosia (D-galaktoosia, jos ollaan täsmällisiä) sidottuna modifioidun galaktoosin yksikkösakkaridiin, 3,6-anihydro-L-galaktoosiin. Kutsumme tätä kaksikkoa AGAROBIOSEKSI (Galaktoosin ja glukoosin yhdistäminen antaa laktoosin, joka on ehkä tutumpi disakkaridi).
Galaktoosissa renkailla on 6 sivua, joissa on 4 -OH-jalkaa, 5 -H-jalkaa, & 1 metyylihydroksyyli (-CH₂OH) -jalka. Usein emme piirrä -H-jalkoja, koska ne peittävät mielenkiintoisemmat jalat, jotka kykenevät reagoimaan. Agaroosin modifioidussa galaktoosissa 2 -OH-ryhmää on kytkeytynyt & potkaissut vedyn pois (“anhydro”) niin, että metyylihydroksyylivarsi on siltautunut -OH-varteen muodostaen “sillan” renkaan yli.
Noin 2/3 agaroosista on agaroosia, mutta, agarissa on myös AGAROPECTINIA. Se on todella samanlainen (siinä on vuorottelevia D & L-galaktooseja), MUTTA monissa näistä galaktooseista on modifikaatioita. On olemassa useita erilaisia modifikaatioita, kuten sulfaatti(e)n, pyruvaattihapon tai metyyliryhmien lisääminen tai sellaisen linkitetyn jalan version lisääminen, kuten agaroosissa.
Toisin kuin AGAROOSIN johdonmukaisesti toistuva luonne, agaropektiinissa on johdonmukainen vain vuorotteleva D- & L- galaktoosin “luuranko”. Sen modifikaatiot ovat hajallaan eri puolilla ketjua (esimerkiksi ~ joka kymmenes on kiinnittynyt sulfaattiin -O-sulfaattisidoksella, mutta se on vain keskiarvo, eikä ole todennäköistä, että ne ovat tarkasti, tasaisesti, jakautuneet). Ja vaikka ketjut ovat yleensä lyhyempiä kuin agaroosiketjut, niiden pituus on myös vaihteleva, joten agaropektiini on oikeastaan melkoinen sekoitus & koskaan ei voi tietää tarkalleen, mitä tulee saamaan!
Miksi käyttää toista toisen sijaan?
DNA:ssa on paljon negatiivisesti varattuja fosfaattiryhmiä (fosfori, jota ympäröi 4 häkägeeniä). Tämä toimii perustana sille, että ne liikkuvat geelin läpi kohti positiivista päätä. Tarvitsemme siis geelin olevan neutraali.
Agarissa on paljon sulfaattiryhmiä (happigeenien ympäröimä rikki). Nämä ovat myös negatiivisesti varautuneita, joten ne voivat häiritä DNA:n liikkumista geelin läpi. Se olisi siis huono matriisi elektroforeesille.
MUTTA agaroosi on neutraalia, joten se on hyvä matriisi elektroforeesille.
MUTTA agaroosi on myös kalliimpaa, koska se on puhdistettava. Joten jos sinun ei tarvitse huolehtia fysikaalisesta varauskysymyksestä, voit yhtä hyvin käyttää jotain, jolla on pienempi *monetaarinen* varaus! Koska agar vaatii vähemmän käsittelyä, se on halvempaa & sopii täydellisesti käytettäväksi matriisina bakteerien ruoan pitämiseen!!!
Agarilevyissä agar ei ole itse agar, joka tarjoaa ravintoaineita. Se on yksi agarin hyvistä puolista – *usein* bakteerit eivät voi syödä sitä. Sen sijaan agar tarjoaa vain “telineet”, joihin bakteerit tarvitsevat ravinteita. Usein nämä ravintoaineet saadaan nestemäisestä bakteeriruokaa sisältävästä “kasvualustasta”, jota kutsutaan LB:ksi, joka on (ainakin alun perin) lyhenne sanoista Lysogeny Broth (lysogeeniliemi), riippumatta siitä, mitä oppikirjoissa sanotaan. Joskus nimestä käytetään Lurian, Lennoxin tai Luria & Bertanin nimikirjaimia, mutta todellisuudessa se tarkoittaa LYSOGENY BROTHia, ja sen resepti julkaistiin ensimmäisen kerran (Giuseppe Bertanin toimesta) vuonna 1951. Hän käytti sitä tutkiessaan lysogeniaa (prosessi, jossa bakteeria infektoiva virus, jota kutsutaan bakteriofaagiksi (“faagiksi”), lisää oman DNA:nsa bakteerin DNA:han & odottelee, kunnes olosuhteet ovat oikeat lysogeenisen faagin tunkeutumiselle, jolloin se leikkaa itsensä ulos, tekee paljon kopioita ja räjäyttää solun auki) http://bit.ly/2HLuB1S
LB:n tarkoitus on periaatteessa antaa bakteereille se, mitä ne tarvitsevat kasvaakseen, jakaantuakseen ja tehdäkseen sitä, mitä haluamme (kuten tehdä kopioita DNA:sta, jonka laitamme niihin ja/tai tehdä kopioita proteiineista, jotka käyttävät niihin laittamiemme DNA:n ohjeita). Ja tehdä se halvalla.
Huomautus: Proteiinien valmistusta ja laajamittaista DNA:n valmistusta varten kasvatamme bakteereja suorassa LB-nesteessä – “suspensiossa” ravistelemalla – mutta kun meidän on eristettävä tiettyjä bakteeriryhmiä, jotka kaikki ovat peräisin samasta “kantasolusta” ja siten geneettisesti identtisiä, upotamme LB-nesteen geeliin niin, että erilaiset geneettisesti erilliset “siirtokunnat” eivät sekoituisi toisiinsa vaan kasvaisivat sen sijaan hyytelöinä pisteinä. Jos haluat oppia lisää erilaisista medioista suspensiojuttuja varten, tutustu tähän viestiin http://bit.ly/bacterialmedia, mutta tänään keskityn geeliin kiinnitettyyn muotoon.
Me emme anna bakteereille viiden tähden ruokaa. Sen sijaan haluamme käyttää mahdollisimman vähän rahaa ja silti antaa niille niiden tarvitsemat ravintoaineet. Vähintäänkin meidän on annettava niille energianlähde, jotain, mitä ne voivat hajottaa (katabolisoida) tehdäkseen ATP:tä – tällaisia asioita voivat olla sokerit, proteiinit, rasvat. Sen lisäksi, että ne pystyvät hajottamaan asioita, niiden on pystyttävä valmistamaan esimerkiksi proteiineja ja DNA:ta (tekemään aineenvaihdunnan anabolista osaa). Tämä edellyttää ravinteita, jotka tarjoavat tarvittavia alkuaineita, kuten hiiltä ja typpeä, joita voi onneksi saada yksinkertaisella reseptillä, joka riittää monille bakteereille.
Pääkomponentteja on 3 (tosin 2 näistä komponenteista on itsessään paljon komponentteja.
- TRYPTONI -> tämä on peptidien seos, joka muodostuu pilkkomalla proteiinia nimeltä kaseiini haimaentsyymillä -> tästä saadaan aminohappoja, joita bakteerit voivat käyttää uusien proteiinien valmistamiseen
- HIIVEN EXTRAKTTI -> tämä hiivan “autolysaatti” on pohjimmiltaan vain sitä, mitä vain sattui olemaan hiivassa (orgaanisia yhdisteitä, mukaan lukien vitamiineja, hivenaineita jne.) – ja jos se oli tarpeeksi hyvää hiivalle…
- NATRIUMKLORIDI (NaCl) (ruokasuola) -> mahdollistaa osmoottisen tasapainon, kuljetuksen jne.
Muutamia tärkeimpiä LB-valmisteita ovat “Miller”, “Lennox”, & “Luria” versiot & ne eroavat toisistaan suolan määrän suhteen. Miller & Bertani hukuttaa bakteerit NaCl:iin (10 g/l), kun taas Lennox käyttää vain 5 g/l ja Luria vain 0,5 g/l -> tällaiset vähäsuolaiset reseptit ovat hyviä, jos käytät suola-herkkää antibioottia. alkuperäisessä paperissa Bertani lisäsi myös glukoosia, mutta useimmat myöhemmät reseptit jättävät sen pois.
Ja pois jättämisestä puheen ollen, meidän on varmistettava, että “jätämme pois” bakteerit, joita emme halua, minkä voimme tehdä “valikoimalla” bakteereille, joita haluamme, käyttämällä valintamediaa, joka sisältää asioita, kuten antibiootteja jne. jotka tukahduttavat niiden asioiden kasvua, joita emme halua kasvattaa. Kun esimerkiksi laitamme geenejä bakteereihin, teemme sen yleensä ympyränmuotoisina DNA-kappaleina, joita kutsutaan plasmideiksi. Suunnittelemme nämä plasmidit niin, että niissä on myös antibioottiresistenssigeeni, joten voimme piikittää ruokaan kyseistä antibioottia ja se voi edelleen kasvaa, mutta muut asiat eivät http://bit.ly/2tcW4ky
On olemassa myös differentiaalisia väliaineita – tämä mahdollistaa “seulonnan” “valinnan” sijaan – et estä asioita kasvamasta, mutta muutat sitä, miten ne näkyvät – esim, käytämme X-galia sinivalkoiseen seulontaan http://bit.ly/2MxNPs2
Kun laitan geenini sisältävän plasmidin bakteereihin ja saan pesäkkeitä, valitsen muutaman näistä pesäkkeistä ja laitan ne nestemäiseen LB:hen (antibioottia sisältävään) kasvamaan yön yli tehdäkseni paljon kopioita plasmidista, minkä jälkeen voin puhdistaa nuo kopiot ja lähettää ne sekvensoitavaksi, jotta voin tarkastaa, ettei niissä ole kirjoitusvirheitä, ennen kuin siirryn ekspressiota valmistelevaan osaan.
Käyttämästäsi mediasta riippumatta sen on oltava steriiliä. Joten autoklavoit sen (työnnä se todella kuumaan, korkeapaineiseen astianpesukoneeseen) -> varmista, että pulloja ei ole suljettu tiukasti tai ne räjähtävät (onneksi en ole tehnyt tätä virhettä) – äläkä kiristä kantta uudelleen, ennen kuin pullot ovat jäähtyneet, tai kannet juuttuvat kiinni (olen *toteuttanut* tämän). Toinen virhe, jota ei kannata tehdä -> älä lisää antibiootteja ennen autoklavointia, tai inaktivoit ne. Me yleensä lisäämme ne vasta juuri ennen kuin olemme valmiita käyttämään niitä.
Yliopistossa tein kaikki mediat itse, mutta täällä käytämme niitä niin paljon, että meillä on “media-maker” -laborantti, joka on uskomaton ja tekee & steriloi bakteerien kasvualustamme. Tiedät, että jokin on käynyt autoklaavissa, jos sen autoklaaviteipin viivat ovat mustat – teippi on lämpötilaherkkä, joten sen väri muuttuu, kun se kuumenee. Haluan todella suunnitella sarjan vitsejä ja/tai trivia-viestejä sisältäviä autoklaaviteippejä – joten jos koko opettaminen ei onnistu, minulla taitaa olla varakeino!
lisää mainituista aiheista (& muut) #365DaysOfScience Kaikki (joissa aiheet lueteltu) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
