Wanneer het aankomt op het kweken van bacteriekolonies, komt LB-agar op de plaat – maar eerst moet je het in gel toestand krijgen (een situatie waar zijn vriend agarose zeker mee te maken kan hebben!) “-ose” is een uitgang die gewoonlijk wordt gebruikt om aan te geven dat iets een suiker is – en agarose is een suiker – maar agar is dat ook! Dus wat is het verschil? Ze zijn verwant, maar ze verschillen meer dan een paar letters en die verschillen maken ze nuttig voor het maken van gelmatrices voor verschillende taken – agarosegels voor het scheiden van DNA-fragmenten op grootte en agargelplaten voor het kweken van bacteriën)
Een gar is een visachtig ding en AGAR (aka agar-agar (serieus!)) is een mengsel van 2 suikers – agaropectine & degene waar we meer bekend mee zijn, agarose. Dus je krijgt agarose door agar te zuiveren. En om te begrijpen waarom je soms wel, maar soms niet die moeite doet, helpt het om iets meer te weten over wat die suikers zijn.
Agarose is een polysacharide (“poly” betekent veel & suikers, dus een polysacharide is een lange keten van zich herhalende suikersubeenheden die aan elkaar zijn vastgemaakt). Het is een voorbeeld van een polymeer. Polymeren zijn lange ketens van zich herhalende subeenheden. Verschillende polymeren hebben subeenheden van verschillende types (b.v. nucleotide subeenheden verbinden zich tot de polymeren die we DNA of RNA noemen; aminozuren verbinden zich tot proteïnen; en monosaccharide suikers ketenen zich tot complexe koolhydraten (zoals agarose!))
Suikers hebben veel hydroxyl (-OH) groepen (waar water zich graag aan hecht, zodat je een gel kunt vormen – een “oneindig” aaneengesloten (zoals 7° van Kevin bacon) polymeernetwerk dat water bevat. (Er volgt nog meer)). Individuele suikereenheden (monosacchariden) nemen vaak ringstructuren aan (zoals het geval is in agarose) waarin de -OH groepen als benen uitsteken. Suikers kunnen dezelfde “linkage” hebben, maar de gekoppelde groepen kunnen op verschillende manieren uitsteken & we gebruiken “L” en “D” om aan te geven naar welke richting in de ruimte de pootjes wijzen. Meer over dergelijke stereochemie hier: bit.ly/2Q8Dnax
Monosacchariden kunnen hun -OH’s gebruiken om aan elkaar te linken. Als je er 2 aan elkaar koppelt, krijg je een disacharide. Voeg er een paar meer toe en je krijgt oligosacchariden (oligo betekent weinig). Koppel er veel en je krijgt een polysaccharide (poly betekent veel).
En over veel gesproken, de meervoudige -OH’s betekenen dat er meerdere potentiële koppelingsplaatsen zijn (die we specificeren door welk aantal “adressen” op de suikerringen worden gekoppeld). Je kunt “vertakkingen” krijgen, maar in agarose heb je lineaire ketens (van ongeveer 400 subeenheden). (Hoewel vertakkingen kunnen worden geïntroduceerd met behulp van “crosslinkers” om agarose te versterken zodat het dingen kan doen zoals size exclusion chromatography (“gel filtratie”) hars maken dat de hoge druk kan weerstaan die wordt opgewekt in FPLC (Fast performance liquid chromatography).
In agarose is de zich herhalende subeenheid een suikerduo (disacharide) van galactose (D-galactose om precies te zijn) gekoppeld aan een gemodificeerde galactose monosacharide, 3,6-anhydro-L-galactose. We noemen dit duo AGAROBIOSE (Als je een galactose aan een glucose koppelt, krijg je lactose, een disacharide waarmee je misschien meer bekend bent).
In galactose hebben de ringen 6 zijden met 4 -OH-benen, 5 -H-benen, & 1 methylhydroxyl (-CH₂OH) been. We tekenen de “-H”-benen vaak niet, omdat ze de interessantere benen verbergen die in staat zijn te reageren. In de gemodificeerde galactose van agarose hebben 2 van de -OH groepen een waterstof & uitgetrapt (“anhydro”) zodat de methylhydroxyl arm is overbrugd naar een -OH arm die een “brug” vormt over de ring.
Over 2/3 van agar is agarose maar, agar bevat ook AGAROPECTIN. Het is echt vergelijkbaar (het heeft afwisselend D & L galactosen) MAAR veel van die galactosen zijn gemodificeerd. Er zijn verschillende modificaties waaronder het toevoegen van sulfaat(en), pyrodruivenzuur, of methylgroepen, of stiekem een van die gekoppelde pootversies zoals in agarose.
In tegenstelling tot de consistente herhalende aard van AGAROSE, is het alleen het afwisselende D- & L- galactose “skelet” dat consistent is in agaropectine. De modificaties zijn verspreid over de keten (bijvoorbeeld, ~elke 10e is verbonden met een sulfaat door een -O-sulfaat verbinding, maar dat is slechts gemiddeld, en het is niet waarschijnlijk dat ze precies, gelijkmatig, verdeeld zijn). En, terwijl de ketens de neiging hebben korter te zijn dan de agaroseketens, is hun lengte ook variabel, dus, agaropectine is echt een mix & je weet nooit precies wat je krijgt!
Waarom de ene boven de andere gebruiken?
DNA heeft veel negatief geladen fosfaatgroepen (fosfor omgeven door 4 oxygenen). Op basis daarvan bewegen ze zich door de gel naar het positieve uiteinde. De gel moet dus neutraal zijn.
Agar heeft veel sulfaatgroepen (zwavel omgeven door oxygenen). Deze hebben ook een negatieve lading, dus kunnen ze interfereren met de manier waarop het DNA door de gel beweegt. Het zou dus een slechte matrix voor elektroforese zijn.
Maar agarose is neutraal, waardoor het een goede matrix voor elektroforese is.
Maar agarose is ook duurder omdat het gezuiverd moet worden. Dus als je je geen zorgen hoeft te maken over de fysieke lading, kun je net zo goed iets gebruiken dat een lagere *monetaire* lading heeft! Omdat agar minder bewerking vergt, is het goedkoper & perfect om te gebruiken als een matrix om bacteriënvoedsel vast te houden!
In agarplaten is het niet de agar zelf die voedingsstoffen levert. Dat is een van de goede dingen van agar – de meeste bacteriën kunnen het niet eten. In plaats daarvan biedt de agar alleen een “steiger” om de voedingsstoffen te huisvesten die de bacteriën nodig hebben. En vaak worden die voedingsstoffen geleverd via een vloeibaar bacterievoedsel “groeimedium”, LB genaamd, dat, ongeacht wat er in je schoolboeken staat, (oorspronkelijk althans) staat voor Lysogeny Broth. Soms krijgen de initialen voor Luria, Lennox, of Luria & Bertani de eer voor de naam, maar het staat echt voor LYSOGENY BROTH en het recept werd voor het eerst gepubliceerd (door Giuseppe Bertani) in 1951. Hij gebruikte het bij het bestuderen van lysogenie (een proces waarbij een bacterie-infecterend virus, een bacteriofaag (“faag”) genaamd, zijn eigen DNA in het DNA van een bacterie invoegt & wacht zijn tijd af totdat de omstandigheden rijp zijn voor het binnendringen van de lytische faag, waar het zichzelf uitsnijdt, maakt veel kopieën en breekt de cel open) http://bit.ly/2HLuB1S
De bedoeling van LB is in feite de bacteriën te geven wat ze nodig hebben om te groeien, zich te delen en te doen wat wij willen (zoals kopieën maken van DNA dat wij in ze stoppen en/of kopieën maken van eiwitten aan de hand van instructies van DNA dat wij in ze stoppen). En om het goedkoop te doen.
Note: Voor het maken van eiwitten en het maken van DNA op grote schaal kweken we bacteriën in LB-vloeistof – “in suspensie” onder schudden – maar wanneer we specifieke groepen bacteriën moeten isoleren die allemaal van dezelfde “moedercel” afstammen en dus genetisch identiek zijn, brengen we die LB in een gel in, zodat verschillende genetisch onderscheiden “kolonies” zich niet vermengen, maar in plaats daarvan groeien als gloopy dots. Als je meer wilt weten over de verschillende media voor het suspensie spul, bekijk dan deze post http://bit.ly/bacterialmedia, maar vandaag ga ik me richten op de gel-gevangen vorm.
We geven de bacteriën geen 5-sterren keuken. In plaats daarvan willen we zo weinig mogelijk geld uitgeven en ze toch de voedingsstoffen geven die ze nodig hebben. Op zijn minst moeten we ze een energiebron geven, iets wat ze kunnen afbreken (kataboliseren) om ATP te maken – dat kunnen suikers, eiwitten, vetten zijn. Naast het afbreken van dingen, moeten ze ook in staat zijn om dingen als eiwitten en DNA te maken (het anabole deel van de stofwisseling). Hiervoor zijn voedingsstoffen nodig die de benodigde elementen leveren, zoals koolstof en stikstof, die je gelukkig kunt krijgen met een eenvoudig recept dat voldoende is voor veel bacteriën.
Er zijn 3 hoofdbestanddelen (hoewel 2 van die bestanddelen zelf weer een heleboel bestanddelen hebben.
- TRYPTONE -> dit is een mix van peptiden gevormd door het verteren van een eiwit genaamd caseïne met pancreasenzym -> dit levert aminozuren die de bacteriën kunnen gebruiken om nieuwe eiwitten te maken
- YEAST EXTRACT -> dit “autolysaat” van gist is in principe gewoon wat er toevallig in gist zat (organische verbindingen inclusief vitaminen, sporenelementen, enz.) – en als het goed genoeg was voor de gist…
- ZEEZWATERSTOF CHLORIDE (NaCl)(tafelzout) -> zorgt voor osmotisch evenwicht, transport, enz.
Een paar van de belangrijkste LB-formuleringen zijn de “Miller,” “Lennox,” & “Luria” versies & ze verschillen in de hoeveelheid zout die ze hebben. Miller & Bertani verdrinken de bacteriën in NaCl (10g/L) terwijl Lennox slechts 5g/L gebruikt en Luria slechts 0,5g/L -> dergelijke lage zout recepten zijn goed als je een zout-gevoelig antibioticum gebruikt. in het oorspronkelijke document, Bertani voegde ook glucose toe, maar de meeste latere recepten laten het weg.
En over dingen weglaten gesproken, we moeten ervoor zorgen dat we bacteriën “weglaten” die we niet willen, wat we kunnen doen door te “selecteren op” de bacteriën die we wel willen met behulp van selectiemedia, die dingen bevatten zoals antibiotica enz. die de groei onderdrukken van dingen die je niet wilt laten groeien. Wanneer wij bijvoorbeeld genen in bacteriën inbrengen, doen wij dat gewoonlijk in de vorm van cirkelvormige stukjes DNA, plasmiden genaamd. We ontwerpen die plasmiden zo dat ze ook een antibiotica-resistentiegen bevatten, zodat we het voedsel met dat antibioticum kunnen bestoken en het nog steeds kan groeien, maar andere dingen niet http://bit.ly/2tcW4ky
Er zijn ook differentiële media – dit maakt “screening” mogelijk in tegenstelling tot “selectie” – je weerhoudt dingen er niet van te groeien, maar je verandert hoe ze verschijnen – bijvoorbeeld, we gebruiken X-gal voor blauw-wit screening http://bit.ly/2MxNPs2
Als ik een plasmide met mijn gen in bacteriën breng en kolonies krijg, pak ik een paar van die kolonies en zet ze in vloeibare LB (met antibioticum) om ‘s nachts te groeien en veel kopieën van het plasmide te maken, dan kan ik die kopieën eruit zuiveren en ze voor sequencing opsturen om te controleren op typefouten voordat ik aan het “expressie prep”-gedeelte begin.
Hoe je de media ook gebruikt, ze moeten steriel zijn. Dus autoclaveer je het (stop het in een echt hete, hoge druk vaatwasser) -> zorg ervoor dat de flessen niet goed afgesloten zijn of ze zullen exploderen (gelukkig heb ik deze fout niet gemaakt) – en draai de deksels niet opnieuw vast voordat de flessen afgekoeld zijn of de deksels zullen vast komen te zitten (ik *heb* deze fout gemaakt). Nog een fout die je niet mag maken -> voeg geen antibiotica toe vóór het autoclaveren, anders inactiveer je ze. Wij voegen het meestal pas toe vlak voordat we klaar zijn om het te gebruiken.
In mijn studietijd, maakte ik al mijn eigen media, maar hier, gebruiken we er zoveel van, we hebben een “media-maker” lab technicus die geweldig is en & steriliseert onze bacteriële groeimedia. Je weet dat iets door een autoclaaf is geweest als de lijnen op de autoclaaf tape zwart zijn – de tape is temperatuurgevoelig dus het verandert van kleur als het echt heet wordt. Ik wil echt een serie autoclaaf tape ontwerpen met moppen en/of weetjes – dus als het hele lesgeven niet lukt, heb ik een backup!
meer over genoemde onderwerpen (& anderen) #365DaysOfScience Alles (met genoemde onderwerpen) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
