Formaldehyde fixatieven

Informatie over 37% Formaldehyde

Er is geen definitieve leeftijd waarna 37% Formaldehyde niet meer bruikbaar is als stockoplossing. De chemie van formaldehyde is tamelijk complex, maar na gesprekken met andere microscopisten, fabrikanten en het bestuderen van relevante teksten, zijn de volgende opmerkingen van toepassing.

• Formaldehyde moet bij kamertemperatuur worden bewaard (koude temperaturen bevorderen de vorming van trioxymethyleen met een resulterend wit neerslag)
• Formaldehyde moet goed afgesloten worden bewaard, omdat blootstelling aan de lucht de oxidatie van formaldehyde tot mierenzuur bevordert (37% formaldehyde wordt gewoonlijk verzonden met 10-15% methanol om deze verandering tegen te gaan).

Onze aanbeveling betreffende 37% voorraadoplossingen: Als een oplossing van 37% formaldehyde helder, kleurloos en zonder neerslag is, en bij kamertemperatuur is bewaard in een goed afgesloten fles die niet aan zonlicht is blootgesteld, zou deze goed moeten zijn, wij raden echter nog steeds niet aan een voorraadfles te gebruiken die ouder is dan 1 jaar. Flessen met 37% formaldehyde die reeds geopend zijn, mogen niet langer dan zes maanden gebruikt worden. Bijgevolg raden wij laboratoria aan hun formaldehyde vaker en in kleinere hoeveelheden aan te kopen dan zij in het verleden misschien hebben gedaan.

Gebruik van 37% formaldehyde wordt niet aanbevolen voor fixatieven voor elektronenmicroscopie. Ofwel een hogere kwaliteit, methanol-vrije formaldehyde of een verse oplossing gemaakt van paraformaldehyde is een veel betere keuze (zie verder commentaar hieronder).

Informatie over 10% formaline

Het fixatief 10% gebufferde formaline wordt vaak gebruikt om weefsels te conserveren voor routine histologie in veel laboratoria. Het formaldehyde heeft een grotere kans op oxidatie in deze concentratie van weefselfixatief en uiteindelijk zal de oplossing in pH beginnen te dalen, ondanks de buffer. Wij bevelen aan dat 10% gebufferde formalineoplossingen niet langer dan 3 maanden nadat zij oorspronkelijk zijn gemengd, worden gebruikt. De oplossing moet helder, kleurloos zijn, zonder neerslag en de pH mag niet lager zijn dan 6,5.

Het andere probleem met 10% gebufferde formaline is de langzaam toenemende concentratie van methanol (een ongewenst bijproduct van het verouderen van formaldehyde). Methanol bevordert het samenklonteren van eiwitten, in plaats van de cross-linking van eiwitten die formaldehyde uitvoert. Een methanolvrij fixatief geeft de beste conservering, vooral als u van plan bent het weefsel later voor antilichaamkleuring te gebruiken.

De meest gebruikelijke manier om methanol in een formaldehyde-oplossing te vermijden, is de oplossing vers te maken van kristallijn paraformaldehyde. Paraformaldehyde kan vrij gevaarlijk zijn om mee te werken en het is vaak moeilijk om het in oplossing te krijgen. Als uw laboratorium niet regelmatig formaldehyde-fixeermiddelen gebruikt, zijn er een paar eenvoudiger opties die wij aanbevelen.

Eén optie is de aankoop van methanolvrij formaldehyde (aq) in verzegelde ampullen. Voeg gewoon PBS toe om de juiste formaldehydeconcentratie te bereiken en gebruik onmiddellijk. Tien ampullen van 10 ml met 16% methanolvrije formaldehyde kosten ongeveer $27.

De andere optie is om 10% neutraal gebufferde formaldehyde (4% formaldehyde) te kopen bij een wetenschappelijke groothandel, het 3-6 maanden te gebruiken en het dan weg te gooien (als een gevaarlijke stof). Er zal wat methanol in deze oplossing zitten (gewoonlijk 1-2%), maar als het snel na aankoop wordt gebruikt, zal dit voor de meeste gebruikers niet significant zijn. De gebufferde oplossing helpt het verzuringsproces te vertragen. Een fles van een liter kost ongeveer $20-25. Bewaar het fixeermiddel bij kamertemperatuur. Lokale lezers van deze pagina kunnen contact opnemen met het CMM Histologie Service Lab (626-4415) als u problemen heeft met het vinden van een leverancier. (Let wel, verschillende leveranciers gebruiken verschillende bufferoplossingen. Voor een consistente immunohistochemie en/of immunofluorescentie dienen gebruikers zich te houden aan één leverancier).

Sommige laboratoria hebben gevraagd of zij ongebufferde 10% formaline mogen gebruiken. Tenzij er een specifieke reden is voor deze keuze, raden wij dit niet aan omdat dit fixatief snel zuur wordt. Het langer dan enkele uren bewaren van weefsel in dit fixatief moet sterk worden afgeraden.

Aanbevelingen voor optimale fixatie

Weefselmonsters moeten zo snel als redelijk is in het fixatief worden geplaatst nadat ze uit een dier zijn verwijderd, het fixatief moet ten minste 20 keer het volume van het weefsel zijn en het fixatief moet na het eerste uur van fixatie worden vervangen.

Weefsel moet zo worden gesneden dat de dunste dimensie niet dikker is dan 4-5 mm (formaline-penetratie is traag, ongeveer 0,5 mm/uur). Dit is ongeveer de dikte van twee Amerikaanse kwartieren. Als het weefsel of orgaan een dik kapsel heeft (bv. een nier), moeten gebruikers zich ervan bewust zijn dat de penetratie van het fixeermiddel door het kapsel niet zo snel zal verlopen. Te dikke monsters kunnen aan de buitenkant te dik worden gefixeerd en aan de binnenkant slecht, wat interpretatieproblemen veroorzaakt door kleuringartefacten.

Initiële fixatie moet bij kamertemperatuur gebeuren omdat de penetratie van formaline verband houdt met de temperatuur van de oplossing. De formaline moet voorzichtig worden geschud voor gebruik om te voorkomen dat een concentratie gradiënt in de fles.

Tijd van fixatie is enigszins afhankelijk van de dikte van het weefsel.

• Monolayers van gekweekte cellen hoeven niet te worden vastgesteld lang, meestal 15-30 min is voldoende. Gekweekte cellen moeten van fixatie gaan in welk protocol het lab van de gebruiker gebruikt voor immunohistochemie/immunofluorescentie.
• Weefsels en organen moeten worden gefixeerd (afhankelijk van hun grootte) gedurende 2 uur tot maximaal 24 uur. Daarna kunnen weefsels gedurende korte perioden (bij voorkeur niet langer dan 3 dagen) in 70% ethanol (aq) worden bewaard. Langere opslag in een van beide oplossingen kan het weefsel te hard worden en leidt tot problemen bij het snijden van de paraffine blokken.

Nauwkeurig volgen van een gestandaardiseerde fixatie protocol zal leiden tot de meest consistente resultaten.

Formalin vs Formaldehyde

We hebben af en toe enige verwarring over het verschil tussen formaldehyde en formaline ondervonden. Dit is een begrijpelijk probleem, daar de termen soms door elkaar worden gebruikt. Het is onjuist om de twee woorden op deze manier te gebruiken. De concentraties van het chemisch fixatief die de twee benamingen vertegenwoordigen zijn zeer verschillend.

Een fixatief dat wordt aangeduid als 10% gebufferde formaline is in feite slechts een 4% oplossing van formaldehyde. Dit komt omdat 10% gebufferde formaline een voorbeeld is van ouderwets histologenjargon waarmee een 10%-oplossing wordt aangeduid die is gemaakt van een voorraadfles met 37-40% formaldehyde (of preciezer: een 3,7-4%-oplossing van formaldehyde).

Veiligheid van formaldehyde

De Amerikaanse Occupational Safety and Health Administration (OSHA) is zeer bezorgd over formaldehyde. Als u geen actueel veiligheidsinformatieblad (MSDS) voor formaldehyde in uw laboratorium hebt, kunt u er een vinden in het SIRI MSDS-archief.

Belieft u bewust te zijn van de gevaren van formaldehyde. De volgende verklaring komt uit een MSDS voor 10% gebufferde formaline:

“GEVAAR! KAN DODELIJK ZIJN BIJ INSLIKKEN. SCHADELIJK BIJ INADEMING OF OPNAME DOOR DE HUID. VEROORZAAKT IRRITATIE AAN HUID, OGEN EN ADEMHALINGSWEGEN. STERK SENSIBILISEREND. KAN BLINDHEID VEROORZAKEN. BRANDBARE VLOEISTOF EN DAMP. VERDACHT KANKERGEVAAR. BEVAT FORMALDEHYDE DAT KANKER KAN VEROORZAKEN. Risico op kanker is afhankelijk van duur en niveau van blootstelling.”

(voor plaatselijke lezers) De University of Arizona Department of Risk Management heeft een zelfstudieprogramma genaamd “Hazard Communication Training for Formaldehyde”. Deze gids laat u kennismaken met alle relevante aspecten van de OSHA-formaldehyde-norm van 1992. Volgens Risk Management “is jaarlijkse opleiding vereist voor personen die formaldehyde-oplossingen van meer dan 0,1% gebruiken of materialen die meer dan 0,1 ppm formaldehyde kunnen afgeven.” Dit zou de meesten van ons omvatten die formaldehyde gebruiken voor histologie of elektronenmicroscopie fixatieven.

Om een kopie van de “Hazard Communication Training for Formaldehyde” hand-out te verkrijgen, kunt u rechtstreeks contact opnemen met de Dept. of Risk Management and Safety (621-1570, University of Arizona faculteit, personeel en studenten alleen).

▲ top of page