Mikroskopia jest niezbędna w wielu aspektach mikologii. Ma 3 główne zastosowania:

1. Wykrywanie grzybów bezpośrednio w próbkach klinicznych – szczególne objawy mogą być bardzo charakterystyczne dla niektórych infekcji, np. infekcji Zygomycete lub tuszu indyjskiego w płynie mózgowo-rdzeniowym. Mikroskopia bezpośrednia, jeśli jest dodatnia, jest szybsza niż hodowla.
2. Potwierdzenie, że hodowla grzybów powietrznych, takich jak Aspergillus, jest przyczyną infekcji i jest mało prawdopodobne, aby była zanieczyszczeniem.
3. Identyfikacja grzybów na podstawie wyglądu morfologicznego.

Poniższa sekcja jest dość techniczna i specyficzna, napisana dla pracownika laboratorium, który chce poprawić wskaźniki wykrywalności i umiejętności raportowania.

Tabela ta przedstawia główne typy próbek i wyniki używane w mikroskopii bezpośredniej.

Próbka	Wykrywanie grzybów i wygląd
CSF	Drożdże Cryptococcus	Przygotowanie atramentu indyjskiego.
Włosy, paznokcie i zeskrobiny skóry	Grzybki dermatofitów lub inne grzyby nitkowate Grzybki Candida	Nierozróżnialne różne grzyby. Posiewy często ujemne, więc mikroskopia jest jedynie dowodem zakażenia.
Śluz z zatok przynosowych	Hyfy wykrywalne w śluzie są diagnostyczne dla eozynofilowego grzybiczego zapalenia błony śluzowej nosa i zatok przynosowych	Śluz powinien być utrwalony i wybarwiony jak wycinki histopatologiczne. Hyphae may be elusive.
Odłamki z jamy ustnej/skrobiny	Hyphae, zwykle z sporulującymi główkami typowymi dla Aspergillus niger.	Sporadycznie zmieszane z komórkami Candida i drożdżami.
Skrobanie rogówki w kierunku zapalenia rogówki	Można zobaczyć drożdżaki lub grzyby nitkowate	Przydatny wczesny objaw grzybiczego zapalenia rogówki, nie pozwala na rozróżnienie gatunku sprawcy
Apirat tkanki lub biopsja	Grzyby strzępkowe Drożdżaki Candida lub inne drożdżaki. Sferułki C. immitis	Niektóre grzyby bardzo charakterystyczne, w tym małe drożdżaki bez strzępek sugerujące C. glabrata, lub nieseptyczne strzępki Zygomycete.
Płyny oddechowe	Drożdżaki bez znaczenia Drożdżaki (bez drożdżaków) zgodne z chorobą Pneumocystis jirovecii	Drożdżaki zwykle przegrodowe i typowe dla Aspergillus, ale jeśli nie są przegrodowe, należy rozważyć zygomikozę lub mukormykozę. Imuunofluorescencja lepsza dla P. jirovecii
Film krwi lub szpik kostny	Drożdżaki wewnątrzkomórkowe typowe dla Histoplasma lub rzadko Penicillium	Cecha rozsianej histoplazmozy i stwierdzana w 40%.
Płyn otrzewnowy	Drożdżaki lub rzadko hieny	Pomocne w potwierdzeniu Candida zapalenie otrzewnej
Wymaz z pochwy	Candida albicans (drożdżaki i strzępki) lub Candida glabrata	Kluczowe test diagnostyczny
Ziarno Mycetoma	Może wykazywać hyphae z cechami	Zwykle nie jest ostateczne w odniesieniu do gatunku

Metodologia otrzymywania

Najstarszym specyficznym preparatem do mikroskopii jest stężony (10-.20%) roztwór wodorotlenku potasu, który zmiękcza keratynę i pozwala na bezpośrednią wizualizację grzybów i pewną ocenę morfologii. Barwienia metodą Grama są mniej czułe. Przydatne mogą być barwniki Papanicolau. Szkiełka cytologiczne mogą być barwione barwnikami Sliver lub Gomori Methenamine Silver (GMS). Mikroskopia immunofluorescencyjna jest najlepszą metodą do wykrywania Pneumocystis. Rozjaśniacze fluorescencyjne (Calcofluor white, Blankophor lub Tinopal UNPA-GX), które wiążą się z chityną w ścianie komórkowej grzyba, są szybkim sposobem skanowania próbek w poszukiwaniu strzępek grzybów i poprawiają ocenę morfologii.

Rola diagnostsza mikroskopii w specyficznych chorobach

Płynsze płysze mózgowe i zapalenie opon mózgowych

Enkapsulowane komórki Cryptococcus mogą być często wykrywane w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego lub innych płynów lub wydzielin gospodarza osadzonych w tuszu indyjskim. Około 50% pacjentów HIV-ujemnych i ponad 80% HIV-dodatnich ma pozytywny wynik badania płynu mózgowo-rdzeniowego tuszem indyjskim. Jednakże, w szczególności nienaruszone limfocyty mogą być mylone z tym organizmem. U osób z AIDS, komórki Cryptococcus są zwykle liczne w płynie mózgowo-rdzeniowym, chociaż kapsułki mogą być małe, co utrudnia rozpoznanie. Utrzymujące się dodatnie wyniki badań płynu mózgowo-rdzeniowego u pacjentów poddawanych leczeniu należy uznać za dowód niepowodzenia lub nawrotu choroby tylko wtedy, gdy są one potwierdzone pogorszeniem stanu klinicznego pacjenta lub dodatnimi wynikami posiewów.

Preparat tuszu indyjskiego z płynu mózgowo-rdzeniowego pokazujący liczne drożdżaki z dużymi kapsułami i wąskimi pączkami do mniejszych komórek potomnych, typowych dla C. neoformans

Przekaźnikowy mikrograf elektronowy komórki C. neoformans widzianej w płynie mózgowo-rdzeniowym u pacjenta z AIDS, z obecnością wyjątkowo małej kapsuły. Komórki te mogą być mylone z limfocytami.

Włóknisty grzyb w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjenta z zapaleniem opon mózgowych, który następnie wyhodował Candida albicans.

Włosy

Próbki ze skóry głowy powinny obejmować korzenie włosów, zawartość zatkanych mieszków włosowych i łuski skórne. Z wyjątkiem favus, dystalna część zakażonego włosa rzadko zawiera grzyby. Z tego powodu obcięte włosy bez korzeni są nieodpowiednie do badań mikologicznych. Jedną z metod, która jest przydatna do pobierania materiału ze skóry głowy jest pobieranie próbek za pomocą szczotki do włosów.

Bezpośrednie badanie mikroskopowe zakażonego materiału powinno ujawnić artrokonidia dermatofita znajdujące się na zewnątrz (ectothrix) lub wewnątrz (endothrix) zakażonego włosa. Artrokonidia mogą być małe (2-4 um średnicy) lub duże (do 10 um średnicy). Łuski skórne zawierają hyphae i arthroconidia. W przypadku zakażenia T. schoenleinii (favus), w obrębie zaatakowanych włosów widoczne są luźne łańcuchy artrokonidiów i przestrzenie powietrzne. Scutulum (skorupa) składa się z grzybni, neutrofili i komórek naskórka.

Skrawek skóry ukazsza nitkowate strzępki z blankophor.

Paznokcie

Jakość pobranej próbki jest głównym czynnikiem decydującym o powodzeniu lub braku pow mikroskopii i hodowli. Pobranie próbki powinno być bezbolesne, poza sporadycznym lekkim dyskomfortem w przypadku pobierania próbek podpaznokciowych. Poniższy rysunek przedstawia odpowiednie miejsca, z których powinny być pobierane próbki paznokci,

Skrawki pobrane tępym skalpelem lub wycinki powinny być transportowane w złożonym kwadracie papieru, najlepiej spiętym spinaczem, ale dostępne są również komercyjne opakowania mykologiczne. W laboratorium do części próbki dodaje się 20-30% roztwór wodorotlenku potasu w celu zmacerowania keratyny paznokcia, tak aby można było zbadać próbkę na obecność elementów grzybiczych pod mikroskopem bezpośrednim. Alternatywnie, część każdej próbki jest badana w roztworze rozpuszczającym paznokcie, zawierającym fluorochrom. Przykładem roztworu reaktywnego jest ten. Przygotowuje się go poprzez rozpuszczenie 1 g Na2S w 7,5 ml wody destylowanej, a następnie dodanie 2,5 ml etanolu. Następnie do tej mieszaniny dodaje się 10 ml Blankophoru lub 20 ml 1% wodnego roztworu Tinopalu UNPA-GX (rozjaśniacz fluorescencyjny 28, F3543; Sigma).

Śluz z zatok przynosowych

Cechą diagnostyczną alergicznego grzybiczego zapalenia błony śluzowej nosa i zatok przynosowych (AFRS) jest obecność eozynofilowych, zawierających mucynę strzępek, pobranych z nosa pacjenta lub jam zatok przynosowych bez dowodów na inwazję tkanek przez grzyby. Hyfusy mogą być nieliczne w treści zatok, a ich uwidocznienie za pomocą obecnie stosowanych barwników wymaga znacznego czasu. Bez tej pozytywnej cechy, zwykle stawiane są inne diagnozy, w tym alergiczne zapalenie nosa i zatok (ARS) lub eozynofilowe mucynowe zapalenie nosa i zatok (EMRS). Jednakże, użycie znacznie bardziej czułych technik diagnostycznych, takich jak barwienie chitynowe lub specyficzne barwienie immunofluorescencyjne anty-Alternaria, może poprawić czułość. Pomocnicze cechy diagnostyczne obejmują obecność kryształów Charcota-Leydena, nadżerek kostnych i niejednorodnego zmętnienia z poszerzeniem zatok w tomografii komputerowej.

Kanał słuchowy i zapalenie ucha zewnętrznego

Z przewodu słuchowego należy pobrać płyn i wydzielinę. Bezpośrednie badanie mikroskopowe ujawni rozgałęzione strzępki, pączkujące komórki drożdżaków lub oba te elementy. W przypadku zakażenia Aspergillus, czasami widoczne są typowe główki rozplemowe.

Skrobanie rogówki w przypadku zapalenia rogówki

Grzybicze zapalenie rogówki jest stanem nagłym i wymaga natychmiastowego rozpoznania i leczenia. Do diagnostyki mikrobiologicznej najlepszy jest materiał pobrany z chorej części rogówki; materiał może być pobrany w postaci zeskrobin z owrzodzonego obszaru lub biopsji, gdy nabłonek rogówki jest nienaruszony, a zakażenie ogranicza się do zrębu rogówki. Skrawki rogówki uzyskuje się za pomocą narzędzia takiego jak platynowa szpatułka, ostrze Beavera, nóż Barda Parkera nr 15 lub tępy nóż do zaćmy. Wymazy z końcówką bawełnianą są mniej skuteczne w usuwaniu martwiczej tkanki rogówki. Materiał należy pobierać wielokrotnie z podstawy i brzegów owrzodzonej części rogówki. Jeżeli materiał został naniesiony na sterylne podłoże, można ponownie użyć tego samego ostrza lub szpatułki w celu pobrania dodatkowego materiału; jeżeli jednak materiał zetknął się z niesterylnym szkiełkiem mikroskopowym, należy zmienić ostrze, a szpatułkę można sparzyć, schłodzić, a następnie użyć ponownie.

Bezpośrednie badanie mikroskopowe wybarwionych rozmazów zeskrobin z rogówki jest najszybszym sposobem postawienia wstępnej diagnozy. Septate hyaline hyphae of filamentous fungi seen could represent species of Aspergillus, Fusarium or Acremonium. Mogą być widoczne barwne, przegrodowe strzępki grzybów z rodzaju Phaeohyphomycetes, takich jak Curvularia. Czasami przyczyną zapalenia rogówki jest Candida spp. i dlatego mogą być widoczne drożdżaki i hieny, co sugeruje tę diagnozę. Mikroskopia konfokalna może być bardziej bezpośrednim sposobem ustalenia rozpoznania.

ab
a. Skrawek rogówki wybarwiony laktofenolem z błękitem bawełnianym wykazuje oddzielne strzępki z Fusarium spp. lub Aspergillus spp. Dr Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Inny zeskrobany fragment rogówki wybarwiony laktofenolem z błękitem bawełny, przedstawiający paciorkowate, przegrodowe hyphae, które nie są typowe ani dla Fusarium spp. ani dla Aspergillus spp, są bardziej spójne z grzybem dematycznym (tj. o brązowym zabarwieniu)

Tkanki i płyny otrzewnowe
Wykrywanie pod mikroskopem typowych pączkujących komórek drożdżowych, pseudohyfusów i/lub prawdziwych hyfusów gatunków Candida w wycinkach tkanek lub normalnie sterylnych płynach ustrojowych wskazuje na inwazyjną kandydozę. Typowo, C. glabrata wytwarza tylko komórki drożdżowe, a tylko C. albicans wytwarza prawdziwe strzępki w tkankach

Barwacz graficzny odwirowanego płynu (w tym przypadku moczu) zawierającego C. albicans, ukazujący formy drożdżakowe i hialfalne, tak często spotykane w tego typu próbkach.

Próbki z układu oddechowego
Badanie plwociny jest pomocne w ABPA, ponieważ hieny mogą być często widoczne z eozynofilami i kryształami Charcota Leydena. Sporadycznie rzadkie infekcje grzybicze mogą być zdiagnozowane przez mikroskopię, kiedy widoczne są sferule lub duże drożdżaki takie jak Blastomyces dermatitidis. Aspergillus lub inne nitkowate strzępki mogą być widoczne w materiale z płukania oskrzeli z grzybiczego zapalenia tchawicy i oskrzeli, czasami z widocznymi sporulującymi główkami. W inwazyjnej aspergilozie płucnej z próbek BAL mikroskopia daje wyższą wydajność niż hodowla, w niektórych ośrodkach w zależności od stosowanej metody. W żadnym z badań nie porównywano metodologii mikroskopii i wydajności hodowli grzybów.

Korek śluzowy badany w mikroskopie świetlnym z KOH, wykazującysza sieć hialinowych, rozgałęziającychnych hyphae typowych dla Aspergillus, od pacjenta z ABPA.

Ten sam preparat próbki z BAL pokazujący hialinowe, przegrodowe hieny typowe dla Aspergillus, barwione Blankophor po lewej i KOH po prawej stronie.

Preparat KOH z płynu z dróg oddechowych wykazujący szerokie, nie przegrodowe hieny, typowe dla Zygomycete.

Film krwi lub szpik kostny

Czułość mikroskopii krwi i szpiku kostnego nie jest wystarczająco wysoka dla większości infekcji grzybiczych, aby uzasadnić czas badania próbek, z wyjątkiem rozsianej histoplazmozy i Penicillium marneffei, zwykle w AIDS.

Mycetoma grain

Rozpoznanie mycetoma zależy od identyfikacji ziaren, które powinny być najlepiej pobrane z nieuszkodzonej krostki (zatoki) przy użyciu sterylnej igły. Dach zmiany powinien być uniesiony, a zawartość zatoki, w tym wszelkie ziarna, wyciśnięta i umieszczona na szkiełku podstawowym. Każde ziarno powinno zostać wyłowione, opłukane w 70% alkoholu, a następnie wypłukane w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przed posiewem. Bezpośrednie badanie mikroskopowe ziaren w 20% wodorotlenku potasu potwierdzi diagnozę mycetoma, a także ujawni, czy organizmem sprawczym jest grzyb czy aktynomyceta. Czarne ziarenka sugerują infekcję grzybiczą; drobne białe ziarenka często wskazują na infekcję Nocardia, a większe białe ziarenka wielkości główki szpilki mogą być pochodzenia grzybiczego lub aktynomycetowego. Małe, czerwone ziarna są specyficzne dla Actinomadura pelletieri, ale żółtawo-białe ziarna mogą być pochodzenia aktynomycotycznego lub grzybiczego. Ziarna aktynomycotyczne zawierają bardzo drobne nitki (<1 um średnicy), podczas gdy ziarna grzybowe zawierają masy krótkich splątanych hyfusów (2-4 um średnicy), które czasami są pigmentowane.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease: a guide to good practice (Report of a Working Group of the British Society for Medical Mycology). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Direct mycological examination in dermatology: a comparison of different methods. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Detection of Pneumocystis jiroveci in respiratory specimals by four staining methods. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.

.