Jeśli chodzi o hodowlę kolonii bakterii, LB-agar staje na wysokości zadania – ale najpierw musisz doprowadzić go do stanu żelu (sytuacja, do której jego przyjaciel agaroza z pewnością może się odnieść!) “-ose” jest końcówką, która jest zwykle używana do wskazania, że coś jest cukrem – i agaroza jest cukrem – ale tak samo jest z agarem! Więc jaka jest różnica? Są spokrewnione, ale różnią się czymś więcej niż tylko kilkoma literami, a te różnice sprawiają, że są przydatne do tworzenia matryc żelowych do różnych zadań – żele agarozowe do oddzielania fragmentów DNA według wielkości i płytki żelowe agarowe do hodowli bakterii)
A gar to rzecz rybopodobna, a AGAR (aka agar-agar (poważnie!)) to mieszanina 2 cukrów – agaropektyny & tego, który jest nam bardziej znany, agarozy. Więc dostajesz agarozę przez oczyszczanie agaru. Aby zrozumieć, dlaczego czasami trzeba się trudzić, a czasami nie, warto wiedzieć nieco więcej o tym, czym są te cukry.
Agaroza jest polisacharydem (“poly” oznacza wiele & cukrów sacharydowych, więc polisacharyd jest długim łańcuchem powtarzających się podjednostek cukrowych połączonych razem). Jest to przykład polimeru. Polimery to długie łańcuchy powtarzających się podjednostek. Różne polimery mają podjednostki różnych typów (np. podjednostki nukleotydów łączą się dając polimery, które nazywamy DNA lub RNA; aminokwasy łączą się tworząc białka; a cukry monosacharydowe łączą się w łańcuchy dając złożone węglowodany (jak agaroza!))
Cukry mają dużo grup hydroksylowych (-OH) (do których chętnie przykleja się woda, pomagając w tworzeniu żelu – “nieskończenie” połączonej (jak 7° Kevina bekonu) siatki polimerowej zawierającej wodę. (więcej na ten temat w dalszej części)). Pojedyncze jednostki cukrowe (monosacharydy) często przyjmują struktury pierścieniowe (jak w przypadku agarozy), w których grupy -OH wystają jak nogi. Cukry mogą mieć to samo “powiązanie”, ale połączone grupy mogą wystawać w różny sposób & używamy “L” i “D”, aby odnieść się do tego, w którą stronę w przestrzeni wskazują nogi. Więcej na takich stereochemii tutaj: bit.ly/2Q8Dnax
Monosacharydy mogą korzystać z ich -OH’s połączyć razem. Łącząc 2 daje to disacharyd. Dodaj jeszcze kilka i otrzymasz oligosacharydy (oligo oznacza kilka). Połącz wiele i otrzymasz polisacharyd (poly oznacza wiele).
I mówiąc o wielu, wiele -OH oznacza, że istnieje wiele potencjalnych miejsc łączenia (które określamy przez który numer “adresy” na pierścieniach cukrowych są połączone). Możesz uzyskać “rozgałęzienia”, ale w agarozie masz liniowe łańcuchy (z około 400 podjednostek). (Chociaż rozgałęzienia mogą być wprowadzane przy użyciu “crosslinkerów” w celu wzmocnienia agarozy, aby mogła robić takie rzeczy jak wykonywanie chromatografii wykluczania rozmiaru (“filtracja żelowa”) żywicy, która może wytrzymać wysokie ciśnienia wytwarzane w FPLC (chromatografia cieczowa o szybkiej wydajności).
W agarozie, powtarzającą się podjednostką jest duet cukrowy (disacharyd) galaktozy (dokładnie D-galaktozy) połączony ze zmodyfikowanym monosacharydem galaktozy, 3,6-anhydro-L-galaktozą. Nazywamy ten duet AGAROBIOSE (Łącząc galaktozę z glukozą otrzymujemy laktozę, disacharyd, który może być bardziej znany).
W galaktozie pierścienie mają 6 stron z 4 odnogami -OH, 5 odnogami -H, & 1 odnogą metylohydroksylową (-CH₂OH). Często nie rysujemy odnóg “-H”, ponieważ ukrywają one ciekawsze odnogi, które są zdolne do reakcji. W zmodyfikowanej galaktozie agarozy, 2 z grup -OH połączyły się & wybijając wodór (“anhydro”) tak, że ramię metylowe hydroksylowe jest zmostkowane z ramieniem -OH tworząc “mostek” nad pierścieniem.
Około 2/3 agaru to agaroza, ale, agar zawiera również AGAROPEKTYNĘ. To jest naprawdę podobne (ma naprzemienne galaktozy D & L) ALE wiele z tych galaktoz ma modyfikacje. Istnieje kilka różnych modyfikacji, w tym dodanie siarczanu(ów), kwasu pirogronowego lub grup metylowych, lub przemycenie w jednej z tych wersji połączonych nóg, jak w agarozie.
W przeciwieństwie do spójnej powtarzającej się natury AGAROZY, to tylko naprzemienny D- & L- galaktozy “szkielet”, który jest spójny w agaropektynie. Jego modyfikacje są rozproszone w całym łańcuchu (na przykład, ~ co 10. jest dołączony do siarczanu poprzez wiązanie -O-siarczanowe, ale to tylko średnio, i nie jest prawdopodobne, że są one dokładnie, równomiernie rozmieszczone). I, podczas gdy łańcuchy mają tendencję do bycia krótszymi niż łańcuchy agarozy, ich długość jest również zmienna, więc agaropectin’s really quite a mix & you never know quite what you’re gonna get!
Why use one over the other?
DNA ma dużo ujemnie naładowanych grup fosforanowych (fosfor otoczony przez 4 oksygeny). To będzie służyć jako podstawa dla nich poruszających się przez żel w kierunku dodatniego końca. Więc musimy żel być neutralny.
Agar ma dużo grup siarczanowych (siarka otoczona przez oksygeny). Są one również ujemnie naładowane, więc mogą przeszkadzać w tym, jak DNA przemieszcza się przez żel. Tak więc byłaby to zła matryca do elektroforezy.
Ale agaroza jest neutralna, dzięki czemu jest dobrą matrycą do elektroforezy.
Ale agaroza jest również droższa, ponieważ musi być oczyszczana. Więc jeśli nie musisz się martwić o ładunek fizyczny, równie dobrze możesz użyć czegoś, co ma niższy ładunek *monetarny*! Ponieważ agar wymaga mniej przetwarzania, jest tańszy & idealny do użycia jako matryca do przechowywania pokarmu dla bakterii!.
W płytkach agarowych, to nie sam agar dostarcza składników odżywczych. To jedna z najlepszych rzeczy w agarze – *większość* bakterii nie może go jeść. Zamiast tego, agar stanowi “rusztowanie” dla składników odżywczych, których bakterie potrzebują. Często te składniki odżywcze są dostarczane przez płynne bakteryjne “podłoże wzrostowe” zwane LB, które, bez względu na to co mówią podręczniki, (przynajmniej pierwotnie) jest skrótem od Lysogeny Broth. Czasami inicjały Luria, Lennox, lub Luria & Bertani dostają kredyt dla nazwy, ale to naprawdę oznacza LYSOGENY BROTH i jego przepis został po raz pierwszy opublikowany (przez Giuseppe Bertani) w 1951 roku. Używał go podczas badania lizogenezy (proces, w którym wirus infekujący bakterie zwany bakteriofagiem (“fag”) wstawia swoje własne DNA do DNA bakterii & odczekuje, aż warunki będą odpowiednie do wejścia faga litycznego, gdzie się wycina, robi wiele kopii i rozrywa komórkę) http://bit.ly/2HLuB1S
Punkt LB jest w zasadzie dać bakterie, czego potrzebują, aby rosnąć, dzielić się i robić to, co chcemy (jak kopie DNA, które włożyliśmy w nich i / lub zrobić kopie białek przy użyciu instrukcji z DNA włożyliśmy w nich). I żeby zrobić to tanio.
Uwaga: Do tworzenia białek i tworzenia DNA na dużą skalę, hodujemy bakterie w czystej cieczy LB – “w zawiesinie” z wstrząsaniem – ale kiedy musimy wyizolować określone grupy bakterii, które pochodzą z tej samej “komórki macierzystej”, a więc genetycznie identyczne, osadzamy tę LB w żelu tak, że różne genetycznie odrębne “kolonie” nie mieszają się, ale zamiast tego rosną jako lepkie kropki. Jeśli chcesz dowiedzieć się więcej o różnych podłożach dla zawiesiny, sprawdź ten post http://bit.ly/bacterialmedia, ale dziś skupię się na formie osadzonej w żelu.
Nie dajemy bakteriom 5-gwiazdkowej kuchni. Zamiast tego, chcemy wydać jak najmniej pieniędzy, a jednocześnie zapewnić im składniki odżywcze, których potrzebują. Jako minimum, musimy dać im źródło energii, coś, co mogą rozłożyć (katabolizować), aby wytworzyć ATP – takimi rzeczami mogą być cukry, białka, tłuszcze. Oprócz rozkładania rzeczy, muszą być w stanie tworzyć takie rzeczy jak białka i DNA (wykonywać anaboliczną część metabolizmu). To wymaga składników odżywczych, które dostarczają potrzebnych pierwiastków, takich jak węgiel i azot, które na szczęście można uzyskać za pomocą prostego przepisu, który wystarczy dla wielu bakterii.
Są 3 główne składniki (chociaż 2 z tych składników same mają wiele składników.
- TRYPTON -> jest to mieszanka peptydów utworzona przez trawienie białka zwanego kazeiną enzymem trzustkowym -> dostarcza to aminokwasów, które bakterie mogą wykorzystać do tworzenia nowych białek
- EKSTRAKT Z DROŻDŻY -> ten “autolizat” z drożdży jest w zasadzie tylko tym, co znalazło się w drożdżach (związki organiczne, w tym witaminy, pierwiastki śladowe, itp.) – i jeśli to było wystarczająco dobre dla drożdży…
- SODIUM CHLORIDE (NaCl) (sól kuchenna) -> pozwala na równowagę osmotyczną, transport, itp.
Kilka głównych preparatów LB to wersje “Miller”, “Lennox”, & “Luria” & różnią się one ilością soli, jaką posiadają. Miller & Bertani topi bakterie w NaCl (10g/L) podczas gdy Lennox używa tylko 5g/L a Luria tylko 0.5g/L -> takie nisko solne receptury są dobre jeśli używasz antybiotyku wrażliwego na sól. w oryginalnej pracy, Bertani dodał również glukozę, ale większość późniejszych receptur ją pomija.
I mówiąc o pomijaniu rzeczy, musimy upewnić się, że “pomijamy” bakterie, których nie chcemy, co możemy zrobić przez “selekcję dla” bakterii, których chcemy, używając pożywek selekcyjnych, które zawierają rzeczy takie jak antybiotyki itp. tłumiące wzrost rzeczy, których nie chcemy rozwijać. Na przykład, kiedy wprowadzamy geny do bakterii, zwykle robimy to w formie kolistych fragmentów DNA zwanych plazmidami. Projektujemy te plazmidy tak, aby miały również gen oporności na antybiotyki, więc możemy dodać do żywności antybiotyk i bakteria nadal będzie mogła rosnąć, ale inne rzeczy już nie http://bit.ly/2tcW4ky
Istnieją również media różnicujące – pozwalają one na “badania przesiewowe” w przeciwieństwie do “selekcji” – nie powstrzymujemy rzeczy przed wzrostem, ale zmieniamy ich wygląd – np, używamy X-gal do screeningu niebiesko-białego http://bit.ly/2MxNPs2
Po umieszczeniu plazmidu z moim genem w bakteriach i uzyskaniu kolonii, wybieram kilka z nich i umieszczam je w ciekłym LB (z antybiotykiem), aby rosły przez noc, aby utworzyć wiele kopii plazmidu, następnie mogę oczyścić te kopie i wysłać je do sekwencjonowania, aby sprawdzić, czy nie ma literówek, zanim przejdę do części “przygotowanie ekspresji”.
Niezależnie od tego, jakich mediów używasz, potrzebujesz, aby były sterylne. A więc autoklawujesz je (wkładasz do naprawdę gorącej, wysokociśnieniowej zmywarki) -> upewnij się, że butelki nie są szczelnie zamknięte, bo eksplodują (na szczęście nie popełniłem tego błędu) – i nie dokręcaj wieczek, dopóki butelki nie ostygną, bo wieczka się zakleją (*popełniłem* ten błąd). Kolejny błąd, którego nie należy popełniać -> nie dodawaj antybiotyków przed autoklawowaniem, bo je unieszkodliwisz. My zwykle dodajemy je dopiero tuż przed użyciem.
W undergrad, zrobiłem wszystkie moje własne media, ale tutaj, używamy tak dużo z tego, mamy “media-maker” technika laboratoryjnego, który jest niesamowity i robi & sterylizuje nasze media wzrostu bakterii. Wiesz, że coś przeszło przez autoklaw, jeśli linie na jego taśmie autoklawu są czarne – taśma jest wrażliwa na temperaturę, więc zmienia kolor, gdy robi się naprawdę gorąco. Naprawdę chcę zaprojektować linię żartów i / lub wiadomości ciekawostki autoklawu taśmy – więc jeśli cała rzecz nauczania nie działa, myślę, że mam kopię zapasową!
więcej na wspomniane tematy (& inne) #365DaysOfScience Wszystkie (z wymienionymi tematami) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
.
