Utrwalacze formaldehydu

Informacje o 37% formaldehydzie

Nie ma ostatecznego wieku, po którym 37% formaldehyd nie jest już użyteczny jako roztwór podstawowy. Chemia formaldehydu jest umiarkowanie złożona, ale po rozmowach z innymi mikroskopistami, producentami i po przejrzeniu odpowiednich tekstów, następujące obserwacje mają zastosowanie.

• Formaldehyd powinien być przechowywany w temperaturze pokojowej (niskie temperatury sprzyjają tworzeniu się trioksymetylenu z powstającym białym osadem)
• Formaldehyd powinien być przechowywany szczelnie zamknięty, ponieważ wystawienie na działanie powietrza sprzyja utlenianiu formaldehydu do kwasu mrówkowego (37% formaldehyd jest zwykle przesyłany z 10-15% metanolem w celu zahamowania tej zmiany).

Nasze zalecenie dotyczące 37% roztworów podstawowych: Jeśli roztwór 37% formaldehydu jest klarowny, bezbarwny i nie ma osadu, a także był przechowywany w temperaturze pokojowej w szczelnie zamkniętej butelce, która nie była wystawiona na działanie promieni słonecznych, powinien być dobry, jednak nadal nie zalecamy używania butelki zapasowej, która jest starsza niż 1 rok. Otwarte butelki z 37% formaldehydem nie powinny być używane dłużej niż 6 miesięcy. W związku z tym zalecamy, aby laboratoria kupowały formaldehyd częściej i w mniejszych ilościach, niż miało to miejsce w przeszłości.

Używanie 37% formaldehydu nie jest zalecane do utrwalania mikroskopii elektronowej. Albo wyższa klasa, formaldehyd bez metanolu lub świeży roztwór wykonany z paraformaldehydu jest znacznie lepszym wyborem (patrz dalsze komentarze poniżej).

Informacje o 10% formalinie

Utrwalacz 10% buforowanej formaliny jest powszechnie stosowany do konserwacji tkanek do rutynowych badań histologicznych w wielu laboratoriach. Formaldehyd ma większą szansę na utlenianie w tym stężeniu utrwalacza tkanek i ostatecznie roztwór zacznie spadać w pH, pomimo buforu. Zalecamy, aby 10% buforowane roztwory formaliny były używane nie dłużej niż 3 miesiące po ich wstępnym zmieszaniu. Roztwór powinien być przejrzysty, bezbarwny, bez osadu, a pH nie powinno być niższe niż 6,5.

Innym problemem z 10% zbuforowaną formaliną jest powoli wzrastające stężenie metanolu (niepożądany produkt uboczny starzenia się formaldehydu). Metanol promuje zlepianie się białek, zamiast sieciowania białek, które wykonuje formaldehyd. Utrwalacz wolny od metanolu zapewni najlepszą konserwację, szczególnie jeśli planujemy użyć tkanki do barwienia przeciwciałami w późniejszym czasie.

Najczęstszym sposobem uniknięcia metanolu w roztworze formaldehydu jest sporządzenie roztworu na świeżo z krystalicznego paraformaldehydu. Paraformaldehyd może być dość niebezpieczny w obsłudze i często trudno jest go wprowadzić do roztworu. Jeśli Twoje laboratorium nie jest regularnym użytkownikiem utrwalaczy formaldehydu, istnieje kilka łatwiejszych opcji, które polecamy.

Jedną z opcji jest zakup formaldehydu bez metanolu (aq) w zamkniętych ampułkach. Wystarczy dodać PBS, aby uzyskać odpowiednie stężenie formaldehydu i natychmiast użyć. Dziesięć 10 ml ampułek 16% formaldehydu bez metanolu kosztuje około $27.

Inną opcją jest zakup 10% neutralnej zbuforowanej formaliny (4% formaldehydu) z naukowego domu zaopatrzeniowego, używać jej przez 3-6 miesięcy, a następnie wyrzucić (jako materiał niebezpieczny). W tym roztworze będzie trochę metanolu (typowo 1-2%), ale jeśli zostanie użyty wkrótce po zakupie, nie powinno to być znaczące dla większości użytkowników. Buforowany roztwór pomaga spowolnić proces zakwaszania. Jednolitrowa butelka kosztuje około 20-25 dolarów. Utrwalacz należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Lokalni czytelnicy tej strony powinni skontaktować się z CMM Histology Service Lab (626-4415), jeśli mają Państwo problemy ze znalezieniem dostawcy. (Należy pamiętać, że różni dostawcy używają różnych roztworów buforujących. Aby uzyskać spójną immunohistochemię i/lub immunofluorescencję, użytkownicy powinni trzymać się jednego dostawcy).

Niektóre laboratoria pytały o używanie niebuforowanej 10% formaliny. O ile nie ma szczególnego powodu takiego wyboru, nie zalecamy go, ponieważ ten utrwalacz szybko staje się kwaśny. Przechowywanie tkanki w tym utrwalaczu dłużej niż kilka godzin powinno być zdecydowanie odradzane.

Zalecenia dotyczące optymalnego utrwalania próbek

Próbki tkanek powinny być umieszczone w utrwalaczu tak szybko jak to możliwe po ich usunięciu ze zwierzęcia, utrwalacz powinien mieć objętość co najmniej 20 razy większą niż objętość tkanki, a utrwalacz powinien być zmieniony po pierwszej godzinie utrwalania.

Tkanka powinna być cięta w taki sposób, aby najcieńszy wymiar nie przekraczał 4-5 mm grubości (przenikanie formaliny jest powolne, około 0,5 mm/godzinę). Jest to w przybliżeniu grubość dwóch ćwiartek amerykańskich. Jeśli tkanka lub narząd ma grubą torebkę (np. nerka), użytkownicy powinni być świadomi, że penetracja utrwalacza przez torebkę nie będzie tak szybka. Zbyt grube próbki mogą być nadmiernie utrwalone na zewnątrz i słabo utrwalone wewnątrz, co powoduje problemy z interpretacją ze względu na artefakty barwienia.

Wstępne utrwalanie powinno odbywać się w temperaturze pokojowej, ponieważ penetracja formaliny jest związana z temperaturą roztworu. Formalinę należy delikatnie wstrząsnąć przed użyciem, aby uniknąć gradientu stężenia w butelce.

Czas utrwalania zależy w pewnym stopniu od grubości tkanki.

• Monowarstwy hodowanych komórek nie muszą być utrwalane długo, zwykle 15-30 minut jest odpowiednie. Wyhodowane komórki powinny przejść z utrwalania do protokołu, który jest używany przez laboratorium użytkownika do immunohistochemii/immunofluorescencji.
• Tkanki i organy powinny być utrwalane (w zależności od ich wielkości) przez 2 godziny do maksymalnie 24 godzin. Następnie tkanki mogą być przechowywane przez krótki okres czasu (najlepiej nie dłużej niż 3 dni) w 70% etanolu (aq). Dłuższe przechowywanie w którymkolwiek z tych roztworów może spowodować nadmierną twardość tkanki, co prowadzi do trudności w sekcjonowaniu bloków parafinowych.

Skrupulatne przestrzeganie standardowego protokołu utrwalania prowadzi do najbardziej spójnych wyników.

Formalina vs Formaldehyd

Od czasu do czasu spotykamy się z pewnym zamieszaniem dotyczącym różnicy między formaldehydem a formaliną. Jest to zrozumiały problem, ponieważ terminy te są czasami używane zamiennie. Używanie tych dwóch słów w ten sposób jest nieprawidłowe. Stężenia utrwalacza chemicznego, które reprezentują te dwie nazwy są zupełnie inne.

Utrwalacz oznaczony jako 10% zbuforowana formalina jest w rzeczywistości tylko 4% roztworem formaldehydu. Dzieje się tak dlatego, że 10% zbuforowana formalina jest przykładem dawnego żargonu histologów opisującego 10% roztwór sporządzony z butelki z zapasem 37-40% formaldehydu (lub dokładniej: 3,7-4% roztwór formaldehydu).

Bezpieczeństwo formaldehydu

Administracja Bezpieczeństwa i Zdrowia w Pracy Stanów Zjednoczonych (OSHA) jest bardzo zaniepokojona formaldehydem. Jeśli nie posiadasz w swoim laboratorium aktualnej Karty Charakterystyki Bezpieczeństwa Materiału (MSDS) dla formaldehydu, możesz ją znaleźć w Archiwum MSDS SIRI.

Proszę być świadomym zagrożeń związanych z formaldehydem. Następujące stwierdzenie pochodzi z MSDS dla 10% zbuforowanej formaliny:

“NIEBEZPIECZEŃSTWO! MOŻE BYĆ ŚMIERTELNE W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA. SZKODLIWY W PRZYPADKU WDYCHANIA LUB WCHŁANIANIA PRZEZ SKÓRĘ. POWODUJE PODRAŻNIENIE SKÓRY, OCZU I DRÓG ODDECHOWYCH. SILNY ŚRODEK UCZULAJĄCY. MOŻE POWODOWAĆ ŚLEPOTĘ. ŁATWOPALNA CIECZ I PARY. PODEJRZENIE ZAGROŻENIA RAKIEM. ZAWIERA FORMALDEHYD, KTÓRY MOŻE POWODOWAĆ RAKA. Ryzyko zachorowania na raka zależy od czasu trwania i poziomu narażenia.”

(dla lokalnych czytelników) Wydział Zarządzania Ryzykiem Uniwersytetu Arizony posiada program do samodzielnej nauki pod nazwą “Hazard Communication Training for Formaldehyde”. Przewodnik ten wprowadzi Cię we wszystkie istotne aspekty normy OSHA z 1992 r. dotyczącej formaldehydu. Według Risk Management “roczne szkolenie jest wymagane dla osób korzystających z roztworów formaldehydu większych niż 0,1% lub materiałów zdolnych do uwolnienia więcej niż 0,1 ppm formaldehydu.” Obejmowałoby to większość z nas używających formaldehydu do utrwalania histologii lub mikroskopii elektronowej.

Aby uzyskać kopię ulotki “Hazard Communication Training for Formaldehyde”, należy skontaktować się bezpośrednio z Dept. of Risk Management and Safety (621-1570, University of Arizona faculty, staff and students only).

▲ top of page

.